Transport d’ADN par des complexes nanotubes de carbone protamine : fonctionnalisation et internalisation cellulaire

DNA transfer by CNT-protamine complexes : functionalization and cellular uptake

• Auteur / Autrice : Cécile Caoduro
• Direction : Hatem Boulahdour, Marc Pudlo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Médecine, biophysique et imagerie médicale
• Date : Soutenance le 11/12/2018
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université de Franche-Comté (1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Nanomédecine, imagerie, thérapeutique (Besançon)
• Jury : Président / Présidente : Souad Ammar
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hatem Boulahdour, Marc Pudlo, Souad Ammar, Stéphane Gerard, Elif Hindie, Tijani Gharbi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphane Gerard, Elif Hindie

Mots clés

Mots clés contrôlés

Internalisation (cytologie)

ADN

Cancer du sein

Thérapie génique

Nanotubes

Mots clés libres

Nanotubes de carbone

Fonctionalisation

Internalisation cellulaire

Carbon nanotubes

Functionalization

Cellular uptake

Résumé

La thérapie génique nécessite l’utilisation de vecteurs efficaces pour acheminer l’information génétique au sein des cellules cibles. Les nanomatériaux, sujet d’un grand nombre de travaux de recherche actuellement, sont ainsi devenus des candidats prometteurs au transport de gènes. Dans ce contexte, nous avons élaboré un vecteur innovant composé d’un nanotube de carbone monoparoi (puNTC) fonctionnalisé par la protamine, une protéine cationique capable de condenser l’ADN. Nous avons préparé des complexes puNTC-protamine par fonctionnalisation non covalente, et comparé à des complexes puNTC-pyrène-ammonium. Nos travaux ont permis de caractériser ces nanovecteurs et de montrer la capacité accrue des complexes puNTC-protamine à transporter l’ADN. Nous nous sommes intéressés aux différents paramètres capables d’influencer l’efficacité de transport cellulaire et avons ainsi mis en évidence une amélioration de l’internalisation cellulaire par l’utilisation de NTC oxydés et courts, associés à des fragments d’ADN de petite taille. Une étude complémentaire de modélisation a permis de corroborer et d’expliquer ces résultats, qui sont la conséquence d’une amélioration de la stabilité des complexes et d’un ratio de charge optimal offerts par les NTC courts et petits fragments d’ADN. Nous avons également étudié le mécanisme d’internalisation cellulaire de nos complexes et démontré que ces derniers traversaient la membrane plasmique par endocytose, processus rapporté par de nombreuses études tandis que d’autres décrivent un mécanisme indépendant de l’énergie. L’analyse de l’état de l’art à ce sujet nous a permis de comprendre que plusieurs mécanismes de passage membranaire sont en fait probablement intriqués, en fonction des conditions expérimentales et des types cellulaires. De part leur efficacité démontrée dans le transfert de gènes, nos complexes puNTC-protamine pourraient devenir vecteurs de piARN, petits ARN largement utilisés dans le développement de thérapies ciblées des cancers

Gene therapy needs efficient vectors to transport genetic information into target cells. Actuallynanomaterials have been intensively investigated and became promising candidates for genedelivery. In this way we developed a novel nanovector based on single-walled carbon nanotubes(SWCNT) functionalized by protamine, a cationic protein capable to condense DNA. We preparedSWCNT-protamine complexes via an established non covalent functionalization and compared them toSWCNT-pyrene ammonium complexes. Our study permitted to characterize these nanovectors and toshow the high efficiency of SWCNT-protamine complexes to transport DNA. We investigated theinfluence of different parameters on cellular uptake and pointed out that oxidized and short CNTassociated with short DNA fragments improved cell internalization. An additional study based onmolecular dynamic simulations allowed to confirm and understand these results. Indeed short SWCNTand small DNA fragments improve complexes stability and offer optimized charge ratio. We also studied our complexes cell internalization pathway and demonstrated that the complexes crossed theplasma membrane barrier by endocytosis, as reported by many studies while others describe anenergy-independent non-endocytotic pathway. The state of art analysis allowed us to understand thatseveral cellular uptake mechanisms are rather complementary, depending on both experimentalprocedures and cell types. Thanks to their recognized efficiency for gene delivery, our SWCNT-protamine complexes could transport piRNA, short RNA widely used in the development of targeted cancer therapy