Isolement et caractérisation de la mycomembrane des mycobactéries

Isolation and characterization of the mycobacterial mycomembrane

• Auteur / Autrice : Laura Chiaradia
• Direction : Etienne Gilles, Maryelle Tropis
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance le 30/01/2018
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie et de biologie structurale (Toulouse ; 1996-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Membrane cellulaire

Mycobactéries

Mots clés libres

Mycobactéries

Fractionnement

Membranes

Lipides

Protéines

Mycobacteria

Membranes

Fractionation

Lipids

Proteins

Résumé

Les mycobactéries, dont les plus connues sont Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, agents étiologiques de la tuberculose et de la lèpre respectivement, présentent une enveloppe complexe et atypique faisant l'objet de nombreuses études dans le cadre de la lutte contre ces pathologies. Cette enveloppe est composée d'une couche externe aussi appelée capsule dans le cas de bactéries pathogènes, d'une paroi (mycomembrane - arabinogalactane (AG) - peptidoglycane (PG)) et d'une membrane plasmique. La membrane externe des mycobactéries, appelée mycomembrane est composée de protéines et majoritairement d'acides mycoliques, acides gras à très longues chaînes a-ramifiés et ß-hydroxylés. Ces derniers sont retrouvés covalemment liés, d'une part au complexe AG-PG dans le feuillet interne de la mycomembrane, et d'autre part au tréhalose au niveau du feuillet externe de la mycomembrane. On trouve également en fonction des mycobactéries des lipides complexes dont la localisation exacte dans l'enveloppe n'est à ce jour pas clairement connue et reste sujette à débats. Ce travail a permis de mettre au point un protocole, en deux étapes majeures, permettant le fractionnement cellulaire de deux espèces mycobactériennes, M. aurum et M. smegmatis. Le but étant d'isoler les deux membranes mycobactériennes afin de déterminer leur composition en terme de lipides mais aussi de protéines. Tout d'abord, des culots enrichis en mycomembranes (liées à l'AG-PG) ou en membranes plasmiques sont obtenus par ultracentrifugations différentielles puis purifiés sur gradients de densité discontinus de saccharose. L'absence de contaminations des membranes entre elles est vérifiée grâce à des marqueurs spécifiques. Il a été montré que les phospholipides qui sont les composants majoritaires de la membrane plasmique sont également présents dans la mycomembrane à côté des mycolates de tréhalose. De plus ce travail a permis de montrer que les lipoglycanes, lipoarabinomannanes et lipomannanes, lipides possédant des propriétés antigéniques, sont retrouvés dans les deux fractions membranaires. Ce travail de fractionnement a été le point de départ d'une étude de protéomique afin d'identifier les protéines retrouvées spécifiquement au niveau de la mycomembrane-AG-PG mais également les protéines de la membrane plasmique, les protéines sécrétées et les protéines solubles, provenant des cytosol et périplasme. Une étude de dynamique par RMN sur les fractions membranaires natives menée conjointement avec l'étude protéomique, devrait permettre de mieux comprendre l'organisation de l'enveloppe cellulaire des mycobactéries ainsi que certains des mécanismes impliqués dans la pathogénicité.

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, etiological agents of tuberculosis and leprosy respectively, are composed of a complex and atypical cell wall, which is the focus of numerous studies in the context of the fight against these pathologies. This cell envelope, to which many biological properties have been attributed, is composed of three entities: an outer layer also called capsule in the case of pathogenic species, a cell wall and a plasma membrane. Within the mycobacterial cell wall, the outer membrane, called mycomembrane, is mainly composed of proteins and mycolic acids, very long chain a-branched and ß-hydroxylated fatty acids. These mycolic acids are found in the inner leaflet of the mycomembrane, covalently linked to the arabinogalactan-peptidoglycan complex (AG-PG), and in the outer leaflet where they are linked to trehaloses. Complex lipids are also known in mycobacteria, and may vary depending on the species, however their exact localization within the cell envelope is not yet clearly known and remains open to debate. In order to better delineate the composition of the two mycobacterial membranes, mycomembrane and plasma membrane, a two-step protocol was developed for cell fractionation of two mycobacterial species, M. aurum and M. smegmatis. Firstly, pellets enriched in mycomembranes (linked to AG-PG) or plasma membranes are obtained by differential ultracentrifugations. Then, these membrane pellets are purified using a sucrose step density gradient. To ensure the absence of cross-contaminations of the membranes, specific markers of each membranes are used. Phospholipids, which are the major components of the plasma membrane, are also found in the mycomembrane with trehalose mycolates. Moreover, this study allowed us to demonstrate that immunogenic lipoglycans, lipoarabinomannans and lipomannans, are found in the two mycobacterial membranes. Once the fractionation successfully achieved, it was possible to initiate proteomic studies in order to identify proteins that are specific of the mycomembrane-AG-PG but also those secreted or present in the soluble fraction, derived from the cytosol and periplasm compartments. Future NMR dynamic studies, to be performed on the native membranes, combined with the proteomic studies will help deciphering the organization of the mycobacterial cell envelope as well as the mechanisms involved in pathogenicity.