Visualisation de protéines individuelles pour la quantification à haute sensibilité du lysat cellulaire

Single molecule protein detection for proteomic profiling

• Auteur / Autrice : Simon Leclerc
• Direction : Youri Arntz, Yuichi Taniguchi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 24/08/2018
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de bioimagerie et pathologies (Strasbourg ; 2018-....)
• Jury : Président / Présidente : Csilla Gergely
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Youri Arntz, Yuichi Taniguchi, Csilla Gergely, Frédéric Cuisinier, Dominique Vautier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Csilla Gergely, Frédéric Cuisinier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bioluminescence

Imagerie spectroscopique

Cellules cancéreuses

Marqueurs biologiques

Sondes fluorescentes

Protéome

Mots clés libres

Molécule individuelle

Marquage du protéome

Protéomique

Microscope à haute sensibilité

Single-molecule

Protein labeling

Proteomic

High sensibility microscopy

Résumé

La quantification du protéome à très haute sensibilitée n’est actuellement pas réalisable, et est un problème pour l’analyse de cellule isolée, d’échantillon rare ou pour la détection de protéine de faible abondance. Afin d’améliorer la sensibilité, une idée est d’utiliser un microscope capable de détecter des protéines individuellement. Il faut pour cela dans un premier temps mesurer la proportion du protéome actuellement marquée par une sonde fluorescente afin de pouvoir faire des mesures quantitatives. Avec des conditions dénaturantes et la détection des amines, on arrive à marquer jusqu’à 75% du protéome d’un lysat cellulaire, avec un marquage plus efficace quand la protéine est de grande taille. Dans un deuxième temps, il faut séparer par la taille le protéome afin de réaliser un profil protéique. Si la puce microfluidique ne permet pas la réalisation d’un profil avec une résolution, le micro SDS-PAGE en est capable en permettant également l’observation du profil par microscopie, autorisant la détection jusqu’à 10 ng de protéines par bande et ainsi permettant d'obtenir un profil à partir de seulement 100 cellules. Cette sensibilité a permis l’identification de quatre lignées cellulaires de cancer du sein, avec un fort potentiel pour une application pour le diagnostic de cellule cancéreuse provenant de petite biopsie, plus facile pour le patient.

Proteomic quantification at very high sensitivity is not achieved yet, even if they are a need to realize this quantification for the analysis of uncommon samples at a single cell level, or for the detection of low abundance protein. To improve this sensitivity, one way is to use a microscope able to detect single-molecule. In this optic, the first step to enable precise quantification is to measure the proportion of the proteome that is labeled by a fluorescent probe. When using strong denaturant conditions combined with a probe able to detect the amine of the protein, we are able to label up to 75% of the proteome from a cell lysate, with an increase in the labeling efficiency when the protein is bigger. The second step necessitates the protein separation by size in order to realize a proteome profile. Two technics were used for that, the microfluidic chip and the micro SDS-PAGE. The second one enables the possibility to scan the profile by microscopy, allowing the detection of up 10 ng of protein and then permits the analysis of only 100 cells. This sensitivity enables the differentiation of 4 different proteome profiles from cell lines originated from breast cancer, with a potential in the diagnostic of cancer cell from a smaller biopsy, allowing a less painful experience for the patient.