Caractérisation et ciblage de la reconnaissance dynamique de Trp37-G lors de l’interaction de la protéine NCp7 de HIV-1 avec des acides nucléiques

Characterization and targeting the dynamic recognition of Trp37-G during the interaction of NCp7 protein of HIV-1 with nucleic acids

• Auteur / Autrice : Rajhans Sharma
• Direction : Yves Mély
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique et biologie structurale
• Date : Soutenance le 10/04/2018
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Barbara Gatto
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérémie Léonard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Barbara Gatto, Florence Mahuteau-Betzer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dissertations universitaires

Protéines nucléocapside

Nucléosides antiviraux

VIH (virus)

Protéines virales

Mots clés libres

VIH-1

Nucléocapside protéine

Analogues nucléosidiques fluorescents

Thiéoguanosine

Primer binding site

SL3

Acides nucléiques dynamique

Fluorescence spectroscopie

Protéine-acides nucléiques interaction

HIV-1

Nucleocapsid protein

Fluorescent nucleobase analogues

Thieoguanosine

Primer binding site

SL3

Nucleic acid dynamics

Fluorescence spectroscopy

Protein-nucleic acids interaction

Résumé

La protéine de la nucléocapside (NC) possède un rôle important dans le cycle de viral du VIH-1 grâce à sa propriété chaperone des acides nucléiques (NA) qui implique la reconnaissance de son résidu Trp37 avec un résidu Guanine de l'acide nucléique cible. Nous avons caractérisé cette reconnaissance dynamique Trp37-G en utilisant des séquences impliquées dans la transcription inverse et l'assemblage de l'ARN génomique. En utilisant les analogues nucléosidiques fluorescents thienoguanosine (thG) et 2-thiényl-3-hydroxychromone (3HCnt), nous avons déterminé l'ensemble des constantes de vitesse cinétiques du mécanisme d’hybridation de la séquence (-)PBS avec (+)PBS en absence et en présence de NC. Nous avons également étudié le rôle du NA sucre dans les complexes NC-ARN et NC-ADN, puisque la protéine NC se lie avec la polarité opposée aux séquences d'ADN et d'ARN. Nous avons confirmé que l'interaction du résidu Trp37 avec les amino-acides de type guanines était critique lors de la formation des complexes avec les deux mutants d’ARN et d’ADN de PBS et de SL3. Enfin, nous avons réalisé un criblage de potentiels inhibiteurs de la protéine NC et examiné les touches identifiées à partir d’un test basé sur la fluorescence de la sonde thG.

Nucleocapsid protein (NC) plays crucial roles in HIV-1 life cycle through its nucleic acid (NA) chaperoning property that involves recognition of it’s Trp37 residue with a Guanine residue of the target nucleic acid sequences. Herein, we characterized this dynamic Trp37-G recognition with sequences involved in reverse transcription and genomic RNA packaging. Using the fluorescent thienoguanosine (thG) and 2-thienyl-3-hydroxychromone (3HCnt) nucleoside analogues, we determined the whole set of kinetic rate constants for annealing of (-)PBS with (+)PBS in the absence and presence of NC. We also investigated the role of NA sugar in NC-RNA and NC-DNA complexes, as NC binds with opposite polarity to DNA and RNA sequences. We confirmed that the interaction of the Trp37 residue with guanines was critical for the formation of complexes with both RNA and DNA variants of PBS and SL3. Finally, we performed screening of NC inhibitors and tested the selected hits on a thG-based assay.