Régulation du suppresseur d'invasion Arpin par les Tankyrases

Regulation of the invasion suppressor Arpin by Tankyrases

• Auteur / Autrice : Angelina Chemeris
• Direction : Alexis Gautreau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 21/09/2018
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE) en cotutelle avec Moskovskij gosudarstvennyj universitet imeni M. V. Lomonosova
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interfaces : matériaux, systèmes, usages (Palaiseau, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École polytechnique (Palaiseau, Essonne ; 1795-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule (Palaiseau ; 1975-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Minard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexis Gautreau, Olga Sokolova, Guillaume Romet-Lemonne, Nicolas David
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Aurélie Bertin, Maria Carla Parrini

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules -- Motilité

Cytologie

Mots clés libres

Arp2/3

Complexe multiprotéique

Motilité

Arp2/3

Multiprotein complex

Motility

Résumé

Le complexe Arp2/3, conservé sur le plan évolutif, joue un rôle central dans la nucléation d’actine branchée, qui entraîne la migration cellulaire, l’endocytose et d’autres processus cellulaire. Récemment, une petite protéine, Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 au front du lamellipode a été découverte et caractérisée. Sur sa partie C-terminale, Arpin possède un motif acide (A), qui est homologue au motif A des différents NPF (Nucleation Promoting Factor). Il a été prédit qu’Arpin peut se lier à deux sites de liaison au complexe Arp2/3, similaire aux domaines VCA des NPF. Ici, nous utilisons la microscopie électronique de particules uniques pour obtenir une reconstruction 3D du complexe Arp2/3 lié à Arpin, à une résolution de 25 Å. Nous avons montré que la liaison d’Arpin induit la conformation ouverte, standard, du complexe Arp2/3. Nous avons confirmé qu’il y a deux sites de liaison sur le complexe Arp2/3 pour Arpin : un à l’arrière de la sous-unité Arp3, et le second localisé entre les sous-unités Arp2 et ARPC1. La distance entre le complexe Arp2/3 et Arpin (5nm) confirme qu’Arpin interagit avec son partenaire via sa queue acide C-terminale non structurée.Nous avons, ensuite, identifié Tankyrases1/2, comme un nouveau partenaire qui se lie à Arpin, par « pull-down ». De façon intéressante, les sites de liaisons d’Arpin aux Tankyrases et à Arp2/3 se chevauchent. Nous avons, par conséquent, démontré qu’il y a une compétition dose-dépendante entre le domaine ARC4 de Tankyrase1 et le complexe Arp2/3.Pour comprendre les principes de l’interaction entre Arpin et Tankyrases, nous avons créé un mutant d’Arpin (ArpinG218D) qui, in vitro, se lie toujours au complexe Arp2/3, mais plus aux Tankyrases. In vivo, ArpinG218D n’est pas capable d’inhiber le complexe Arp2/3, ce qui suggère que Tankyrase pourrait être nécessaire pour l’interaction entre Arpin et le complexe Arp2/3. Arpin est le facteur responsable du changement de direction des cellules migrantes. Nous avons donc analysé, la migration de cellules MCF10A exprimant soit la forme sauvage d’Arpin (ArpinWT) soit son mutant ArpinG218D en parallèle de la déplétion d’Arpin endogène. Les cellules exprimant ArpinG218D ont une persistance de migration supérieure, similaire à celles déplétées d’Arpin endogène. Nous avons, ainsi, fait l’hypothèse que le mutant ArpinG218D ne peut pas inactiver le complexe Arp2/3 car il n’est pas présent au niveau du lamellipode. Nous avons donc comparé la quantité de protéine d’ArpinWT et d’ArpinG218D dans la fraction membranaire de cellules migrantes. Une différence significative (44%) dans la quantité d’ArpinWT et d’ArpinG218D a confirmé notre hypothèse.Les Tankyrases sont des cibles thérapeutiques dans de nombreux cancers, mais il n’existe pas de modèle structural pour ces protéines grandes et flexibles. Dans ce travail, nous avons, pour la première fois, obtenu deux reconstructions 3D de Tankyrase1 et Tankyrase2 complètes liées à Arpin en utilisant la microscopie électronique de particules uniques. La résolution obtenue (27 Å) a été suffisante pour détecter un changement de conformation dramatique des domaines SAM et PARP de Tankyrase après fixation d’Arpin. Dans notre reconstruction, trois molécules d’Arpin se lient aux domaines ARC1, ARC4 et ARC5 de Tankyrase1. ARC5 a été montré pour être la partie le plus flexible de l’ensemble des domaines ARC.Grâce aux données que nous avons obtenues, nous avons suggéré un modèle de régulation de l’activité d’Arpin par les Tankyrases. Selon notre modèle, les Tankyrases se lient à Arpin dans le cytoplasme, changent sa conformation et amènent Arpin au niveau de la membrane dans le lamellipode. Traduisant les signaux extracellulaires, la GTPase Rac active Arpin, qui séquentiellement inactive le complexe Arp2/3, tandis que les Tankyrases sont libérées.

The evolutionarily conserved Arp2/3 complex plays a central role in nucleating the branched actin filament arrays that drive cell migration, endocytosis, and other processes. Recently, an inactivator of the Arp2/3 complex at the lamellipodium tip, a small protein, Arpin, was discovered and characterized. On its C-terminus, Arpin possesses an acidic (A) motif, which is homologous to the A-motif of various Nucleation Promoting Factors (NPFs). It was predicted that Arpin can bind at two binding sites to the Arp2/3 complex, similar to VCA domains of NPFs. Here, we used single particle electron microscopy to obtain a 3D reconstruction of the Arp2/3 complex bound to Arpin at a 25Å resolution. We showed that the binding of Arpin causes the standard open conformational of the Arp2/3 complex. We confirmed that there are two binding sites on the Arp2/3 complex for Arpin: one on the back of the Arp3 subunit, and the second is located between Arp2 and ARPC1 subunits. The distance between the Arp2/3 complex and Arpin (5 nm) supports the view that Arpin interacts with its partner via its unstructured C-terminal acidic tail.Next, using the pull-down assay, we identified the new Arpin binding partners, Tankyrases1/2. Interestingly, Tankyrases and the Arp2/3 complex possess overlapping amino acid sequences at Arpin binding sites. Hence, we demonstrated a competition between the ARC4 domain of Tankyrase1 and the Arp2/3 complex in a dose-dependent manner.To understand the principles of Tankyrases-Arpin interaction, we created a mutant Arpin (ArpinG218D) that lacks its ability to interact with Tankyrases, but not with the Arp2/3 complex in vitro. Interestingly, ArpinG218D was not able to inhibit the Arp2/3 complex in vivo, suggesting that Tankyrase may be necessary for Arpin-Arp2/3 complex interaction. Arpin is the turning factor of migrating cells, so we performed a migration analysis of MCF10-A cells expressing either wild type Arpin (ArpinWT) or mutant ArpinG218D in parallel with the depletion of endogenous Arpin. Cells expressing ArpinG218D had higher directional persistence, similar to the cells where the endogenous Arpin was knocked down. Thus, we suggested that mutant ArpinG218D cannot inactivate the Arp2/3 complex since it is not present at the lamellipodial tip. We compared the amount of protein for both ArpinWT and ArpinG218D in the membrane fraction of the migrating cells. A significant difference (44%) in the amount of ArpinWT and Arpin G218D was consistent with our hypothesis.Tankyrases are therapeutic targets in a variety of cancers, but currently there is no structural model available for these large and flexible proteins. In this work, we obtained for the first time two 3D reconstructions of full-length Tankyrase1 and Tankyrase1 bound to Arpin using single particle electron microscopy. The achieved resolution (27Å) was enough to detect a dramatic conformational change in Tankyrase SAM and PARP domains upon binding of Arpin molecules. In our reconstruction, three Arpins were bound to the ARC1, ARC4 and ARC5 domains of Tankyrase1. ARC5 was shown to be the most flexible part of the ARC cluster.Based on the obtained data, we suggested a model of regulation of the activity of Arpin by Tankyrases. According to our model, Tankyrases bind Arpin in the cytoplasm, change their conformational state and bring Arpin closer to the membrane in the lamellipodia. Deciphering the extracellular signals, Rac GTPase activates Arpin, which sequentially inactivates the Arp2/3 complex, while Tankyrases are released.