Thèse soutenue

Etudes structure-fonction des β-lactamases pour la conception rationnelle de pan-inhibiteurs
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Auteur / Autrice : Agustin Zavala
Direction : Thierry NaasBogdan Iorga
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
Date : Soutenance le 19/12/2018
Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure dynamique, expression et fonction de bêta-lactamases de spectre large
établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
Jury : Président / Présidente : Laurent Salmon
Examinateurs / Examinatrices : Thierry Naas, Laurent Salmon, Richard Bonnet, Pierre Bogaerts, Katy Jeannot, Carine Van Heijenoort
Rapporteurs / Rapporteuses : Richard Bonnet, Paulette Charlier

Mots clés

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Résumé

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La résistance antimicrobienne est devenue un problème majeur de santé publique. L’usage parfois abusif d’antibiotiques conduit à la sélection et à la propagation mondiale de mécanismes de résistance. Grâce à leur efficacité clinique et faible toxicité, les β-lactamines sont les antibiotiques les plus prescrits actuellement, et le mécanisme de résistance le plus répandu est l’expression de β-lactamases. Dans ces conditions, le développement de nouveaux traitements antimicrobiens, pour des cibles connues ou nouvelles, est essentiel. Plus particulièrement, le développement de nouveaux inhibiteurs des β-lactamases est très prometteur, permettant de continuer l’utilisation des antibiotiques existants. Les études biochimiques et structurales des nouvelles β-lactamases et leurs mutants synthétiques, par cristallographie aux rayons X ou par différentes techniques de modélisation moléculaire (modélisation par homologie, « docking », dynamique moléculaire, analyse du réseau des molécules d’eau) permettent une meilleure compréhension de ces enzymes. Dans ce contexte, nous avons caractérisé plusieurs β-lactamases du point de vue phénotypique, biochimique et structural.La β-lactamase CMY-136 contient une mutation inhabituelle, Y221H, par rapport à CMY-2, dans une position qui est très conservée parmi les enzymes de classe C. Les études cristallographiques et de modélisation moléculaire ont révélé des interactions stériques défavorables autour de la position mutée 221 qui peuvent affecter la conformation et la dynamique de la boucle Ω, et qui pourraient expliquer l’hydrolyse plus efficace des substrats volumineux et l’affinité plus faible de la plupart des substrats par rapport à la CMY-2.La structure cristallographique de la β-lactamase OXA-427, une nouvelle carbapénèmase de classe D, montre une Lys73 très peu carbamoylée, ce qui est très inhabituel pour cette classe d’enzyme, ainsi qu’un pont hydrophobe à proximité du site actif. Les simulations de dynamique moléculaire ont montré que la boucle β5-β6 est plus flexible et dans une conformation étendue. Ces résultats peuvent expliquer le profil d’hydrolyse unique observé expérimentalement pour cette enzyme.Les modifications dans la boucle β5-β6 de la β-lactamase OXA-48 (mutations d’alanines, délétions systematiques, remplacement par la boucle β5-β6 de la β-lactamase OXA-18) provoquent des modifications importantes dans le profil d’hydrolyse, avec une acquisition graduelle d’une activité cephalosporinase et une diminution de l’activité carbapénémase dans certains cas. Des études de cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire suggèrent que les différences de conformation et de flexibilité dans cette boucle et les régions adjacentes permettent une meilleure fixation des céphalosporines plus volumineuses, par rapport à l’OXA-48. L’analyse de la dynamique des molécules d’eau dans le site actif montre des changements qui sont potentiellement responsables de la diminution de l’activité par rapport aux carbapénèmes. En complément des études sur les mutants naturels, ces résultats confirment l’importance de la boucle β5-β6 pour la spécificité de substrat des enzymes de type OXA-48. La structure cristallographique du mutant 217ΔP de l’OXA-48 présente une conformation auto-inhibée inattendue, induite par la présence d’un ion nitrate, un inhibiteur auparavant inconnu des β-lactamases de classe D.La Beta-Lactamase DataBase(BLDB, http://bldb.eu) développée dans notre équipe est une ressource publique exhaustive contenant des données relatives aux β-lactamases, vérifiées et mises à jour régulièrement. Cette base de données contient tous les mutants naturels et synthétiques de β-lactamases, ainsi que toutes les structures 3D disponibles dans la PDB et la caractérisation phénotypique.Globalement, ces résultats représentent le prérequis pour une meilleure compréhension des relations structure-fonction des β-lactamases et pour le futur développement rationnel d’inhibiteurs pour ces enzymes.