RAD51 protège contre les processus de réparation des cassures double brin de l'ADN non-conservatifs dépendants de RAD52 en empêchant l'étape d'appariement

RAD51 Protects Against RAD52-Dependent Non-Conservative Double-Strand Break Repair Processes, by Impeding the Annealing Step

• Auteur / Autrice : Ayeong So
• Direction : Josée Guirouilh-Barbat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 02/07/2018
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome et cancers (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Fabrice Fleury
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Josée Guirouilh-Barbat, Fabrice Fleury, Guy-Franck Richard, Bernard Lopez, Pauline Dupaigne, Carine Giovannangeli
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Guy-Franck Richard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine Rad52 de réparation-recombinaison de l'ADN

Rad51 Recombinase

Cassures double-brin de l'ADN

ADN -- Réparation

Mots clés libres

Réparation des CDBs

Rad51

Rad52

DSB repair

Rad51

Rad52

Résumé

Les cellules utilisent deux stratégies principales pour réparer les cassures double-brin (CDB) de l’ADN : la recombinaison homologue (RH) et la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ). D’autres voies de réparation plus minoritaires existent qui mènent nécessairement à des altérations génétiques : Single Strand Annealing (SSA) et Alternative End Joining (A-EJ). Nous avons proposé que le choix entre les mécanismes de réparation des CDB nécessite deux étapes : 1) la compétition entre C-NHEJ et la résection, 2) sur les extrémités d’ADN résectées, la compétition entre RH, A-EJ et SSA. Ici, nous avons étudié la régulation de la deuxième étape de ce choix. En outre, la létalité synthétique a été décrite entre RAD52 et BRCA2/PALB2. Étant donné que BRCA2 et PALB2 sont nécessaires pour le chargement de RAD51 sur l’ADN simple brin, cela suggère que la formation d’un nucléofilament RAD51/ADNsb ordonné et RAD52 sont des acteurs essentiels dans le choix de la réparation à la deuxième étape. Nous avons trouvé que l’extinction de RAD51 ou BRCA2 stimule à la fois le SSA et EJ, d’une manière épistatique et que RAD52 contrôle la stimulation de SSA et A-EJ, en absence de RAD51. De plus, par séquençage haut débit, nous montrons que l’inhibition de RAD51 induit une instabilité génomique médiée par la microhomologie au niveau du génome. Cependant l’inhibition de RH n’est pas la réparation directe suffisante vers SSA et A-EJ. En effet, en utilisant des mutants dominants négatifs de RAD51, nous avons trouvé que les mutants du site de fixation/hydrolyse de l’ATP inhibent la RH et stimulent le SSA et que la chimère SMRAD51, qui inhibe la RH, inhibe également le SSA et EJ. Par TEM, nous avons observé que SMRAD51 perturbe spécifiquement la structure de l’ADNsb/SMRAD51. De l’autre côté, deux mutants d’hydrolyse de l’ATP de RAD51 ont montré que la liaison à l’ATP et l’hydrolyse d’ATP sont nécessaires pour une charge efficace de RAD51 sur l’ADN endommagé, dans les cellules vivantes. Ces deux mutants d’ATP ne se fixent pas à l’ADN en opposition à SMRAD51. Enfin, nous montrons que RAD51 n’empêche pas la résection étendue, mais que, in vitro, la protéine RAD51 empêche l’annealing de l’ADNsb complémentaire. Au total, les données montrent que RAD51 joue effectivement un rôle crucial dans la deuxième étape du choix de la voie de réparation des CDB à travers deux mécanismes distincts : 1- il déclenche la RH par son activité catalytique, 2- mail il empêche également les mécanismes non conservateurs dépendants de RAD52, SSA et A-EJ, en altérant l’étape de l’annealing. Par conséquent, le choix en deuxième étape entre la RH et les mécanismes mutagènes, SSA et A-EJ, est orchestré par un antagonisme entre RAD51 et RAD52.

Cells use two primary strategies to repair DNA double-strand break (DSB): Homologous Recombination (HR) and Non-homologous end joining (NHEJ). Beside other mechanisms exist that necessarily lead to genetic alterations: Single Strand Annealing (SSA) and Alternative End Joining (A-EJ). We have proposed that the choice between DSB repair mechanisms requires two steps: 1) competition between C-NHEJ and resection; 2) on resected DNA ends, competition between HR, A-EJ and SSA. Herein we investigated the regulation of the second step of this choice. Furthermore, synthetic lethality has been described between RAD52 and BRCA2/PALB2. Since BRCA2/PALB2 are required for the loading of RAD51 onto the ssDNA, suggesting that both the formation of an ordered RAD51/ssDNA nucleofilament and RAD52 are central players in the choice of repair at the 2nd step.We found that silencing RAD51 or BRCA2 stimulate both SSA and EJ, in an epistatic manner and that silencing RAD51 induced microhomology mediated genomic instability at a genome wide level. Moreover, we show that RAD52 controls the stimulation of SSA and A-EJ, upon RAD51 silencing. However inhibition of HR is not sufficient redirect repair toward SSA and A-EJ. Indeed, using dominant negative mutants of RAD51 we found that the chimera SMRAD51, which inhibits HR, also inhibits SSA and EJ. By TEM we observed that SMRAD51 specifically disrupts the structure of the ssDNA/SMRAD51. On the other side, two ATP hydrolysis mutants of RAD51 showed that ATP binding and hydrolysis is required for efficient loading of RAD51 on damaged DNA, in living cells. These two ATP mutants that do not bind DNA in opposition to SMRAD51, do not inhibit A-EJ and stimulate SSA. Finally we show RAD51 do not prevents extended resection, but that, in vitro, RAD51 protein prevents the annealing of complementary ssDNA.Altogether the data show that RAD51 indeed plays a pivotal role in the second step of DSB repair pathway choice through two separable mechanisms: 1- it triggers HR through its catalytic HR activity 2- but it also prevents RAD52-dependent non-conservative mechanisms SSA and A-EJ, by impairing the annealing step. Therefore, the choice between HR and alternative mutagenic mechanisms A-EJ and SSA (2nd step) is orchestrated by an antagonism between RAD51 and RAD52