Développement de bibliothèques de protéines artificielles permettant la création d’outils de reconnaissance moléculaire innovants

Development of artificial protein libraries for the creation of innovative molecular recognition tools

• Auteur / Autrice : Margarida Gomes
• Direction : Philippe Minard, Ghérici Hassaïne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 01/02/2018
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Nessler
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Minard, Ghérici Hassaïne, Sylvie Nessler, Gilles Truan, Mireille Dumoulin, Patrick Chames
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Gilles Truan, Mireille Dumoulin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Évolution moléculaire

Mutagénèse dirigée

Reconnaissance moléculaire

Mots clés libres

Bibliothèques

Protéines Artificielles

Phage Display

Libraries

Artifficial proteins

Phage display

Résumé

Le travail de thèse présente une approche innovante pour la construction d’une bibliothèque de protéines basées sur l’ossature protéique. L’objectif est de générer une source de biodiversité artificielle permettant la création de nouvelles capacités d’interaction avec des cibles d’intérêts. Une banque, basée sur une ossature protéique bactérienne avait déjà été construite dans l’équipe, mais elle nécessitait d’être optimisée. L’étape initiale a été d’explorer les raisons de l’instabilité des protéines de la banque de première génération, ceci par des approches d’étude de la structure in silico suivie d’une stratégie de mutagenèse dirigée. Des positions déstabilisantes existant dans la première banque ont donc été remplacées dans la banque de deuxième génération. La deuxième étape a eu pour objectif de diminuer le nombre de positions diversifiées et de simplifier le schéma de diversification des variants de la banque. Puis un procédé de filtration et de shuffling de ces variants a été mis au point pour augmenter la proportion de séquences codantes correctes. Une nouvelle stratégie de filtration basée sur la technique d’exposition sur phage a été élaborée, en exploitant le fait que la protéine matrice de la banque, l'ossature protéique a un partenaire biologique capable d’interagir sur la zone « constante », non modifiée par le schéma de diversification. Ainsi les variants de la banque exposés dans une conformation correcte à la surface des phages ont pu être capturés par ce partenaire. Ensuite, les séquences correspondant à ces variants ont été recombinées entre elles pour recréer une plus grande diversité utile. Une bibliothèque optimisée composée de 2.8 x 108 protéines indépendantes a ainsi été obtenue. Cette nouvelle banque optimisée a permis de sélectionner par Phage display, des interacteurs contre plusieurs cibles de structures différentes. Ces nouveaux interrupteurs sont spécifiques de leurs cibles et présentent des affinités de l’ordre du μM. Une approche de séquençage à haut débit a également été entreprise pour réaliser une analyse plus approfondie des séquences de cette bibliothèque et de notre processus de sélection. Cette approche nous a apporté une nouvelle dimension pour la caractérisation des banques construites au laboratoire notamment concernant la diversité réelle de ces banques. Pour le suivi de sélections, nous avons appréhendé le séquençage haut débit comme un moyen d’identifier les interacteurs spécifiques d’une cible par l’analyse exhaustive des séquences issues des sélections. L’objectif est ici de mettre au point un protocole utilisant l’approche NGS pour identifier les interacteurs spécifiques isolées par Phage Display.

Here new methods to build a library of artificial proteins based on a new protein framework have been developed. The objective is to generate a source of artificial biodiversity allowing the creation of new interaction capacities with various specific targets. A first-generation library was previously built with this scaffold, but it needed to be optimized. The first step was to explore the reasons of the instability of the first generation proteins library through an in silico approaches followed by a site-directed mutagenesis strategy. The second step was to reduce the number of diversified positions and simplify the randomization scheme of the variants of the library. Then a method of filtering and shuffling of the variants of the bank was elaborated. To increase the proportion of correct coding sequences, a new filtration strategy based on the phage display technique has been developed, exploiting the fact that the scaffold of the librarie. This scaffold has a particularly interesting biological partner able to interact on the ''constant'' zone. This filtration made it possible to recover a set of well-folded clones. Then, DNA sequences corresponding to these clones were recombined with each other to recreate a greater useful diversity. An optimized library of 2.8 x 108 independent proteins was obtained. This new optimized library has enabled us to select, by a phage display approach, binders against several targets of different structures. These new binders are specific for their targets and have affinities in the μM range. A high throughput sequencing (NGS) approach was also undertaken to further analyse the library sequences and the selection process. This approach offers a new dimension for the characterization of the library built in the laboratory, especially concerning it actual diversity. To follow the selections, we have considered the NGS as a way to identify the target-specific binders through exhaustive analysis of the sequences obtained from selections. The objective here is to develop a general protocol using the NGS approach to identify specific binders isolated by Phage Display.