Exploration de la face cachée du métabolisme bactérien chez Acinetobacter baylyi ADP1
Auteur / Autrice : | Marion Thomas |
Direction : | Marcel Salanoubat |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Sciences de la vie et de la santé |
Date : | Soutenance le 04/10/2018 |
Etablissement(s) : | Université Paris-Saclay (ComUE) |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Génomique métabolique (Evry, Essonne ; 2000-....) - Structure et évolution des génomes / SEG |
établissement opérateur d'inscription : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....) | |
Jury : | Président / Présidente : Florence Gonnet |
Examinateurs / Examinatrices : Marcel Salanoubat, Florence Gonnet, Olivier Lequin, Carlos Afonso, Alain Perret, Anne-Emmanuelle Hay | |
Rapporteur / Rapporteuse : Olivier Lequin, Carlos Afonso |
Mots clés
Mots clés contrôlés
Mots clés libres
Résumé
La connaissance du métabolisme demeure incomplète mais sa compréhension reste un but majeur tant pour la recherche fondamentale qu’appliquée. Environ 40% des gènes des organismes procaryotes n’ont pas de fonction précise proposée. En conséquence, de nombreuses voies métaboliques sont incomplètes et d’autres restent à découvrir. Ces lacunes rendent très difficile la modélisation et la compréhension du métabolisme d’une cellule. Le laboratoire développe une nouvelle stratégie pour mettre au jour des voies métaboliques inconnues. Celle-ci est basée sur la bactérie modèle du laboratoire, Acinetobacter baylyi ADP1 (AP1). Elle exploite la banque complète de mutants de délétion de cet organisme (2600 mutants) ainsi que les avancées récentes du laboratoire dans le domaine de la métabolomique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à très haute résolution (LC/MS).Cette étude est liée à l’observation que lors d’un changement de source de carbone (succinate vs quinate) ADP1 produit de nombreux métabolites d’identité inconnue, non reliés à notre connaissance de son métabolisme. Ces métabolites orphelins (MO) participent à des voies métaboliques nouvelles et représentent des points d’entrée dans la partie obscure du métabolisme bactérien.Ce projet comporte deux volets. Il s’agit d’une part de procéder à l’élucidation structurale des MO et d’autre part d’identifier l'ensemble des gènes impliqués dans leur synthèse.Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons établi l’identité d’un premier MO : l’acide 3-(3-aminopropylamine)- 4-hydroxybenzoïque. Ce composé est un bien métabolite nouveau, jamais référencé auparavant. Dans un premier temps, des expériences de LC/MS impliquant notamment des fragmentations séquentielles MSn et des échanges isotopiques H/D ont permis de déterminer sa composition élémentaire, son nombre de protons échangeables et ont suggéré une structure aromatique de la molécule. Ensuite, son identification a nécessité sa purification à l’échelle de la centaine de µg. Puis, une analyse RMN complète (1H, 13C, COSY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, et 1H-15N HMBC) a permis de préciser sa structure.Par ailleurs, pour identifier les gènes impliqués dans la synthèse des MO, nous avons procédé à l’analyse métabolomique de l’ensemble des mutants de la collection d’ADP1. Pour cela, nous avons développé des protocoles à haut-débit pour la préparation des métabolomes (100 métabolomes par jour), l’acquisition des données LC/MS (8 minutes par acquisition) et enfin leur analyse automatisée. Nous regardons, pour chaque mutant, quels sont les MO présents et absents. L’absence d’un MO chez un mutant donné indique que le gène excisé est impliqué dans sa synthèse. L’analyse systématique de la banque doit permettre in fine de dresser la liste de tous les gènes impliqués dans la synthèse de chaque MO. Les résultats du criblage, toujours en cours, permettront ainsi de commencer à reconstituer ces voies métaboliques nouvelles.