Caractérisation de nouveaux biomarqueurs et développement d’un test rapide pour l’amélioration du diagnostic des maladies hépatiques

Characterization of new biomarkers and development of a rapid test for liver diseases diagnosis improvement

• Auteur / Autrice : Arnaud Chalin
• Direction : Laurence Amiot, Michel Samson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 15/11/2018
• Etablissement(s) : Rennes 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : ComuE : Université Bretagne Loire (2016-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IRSET

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transaminases

Diagnostic

Foie -- Maladies

Fibrose

Mots clés libres

Immunochromatographie par flux latéral

Ast

Cxcl10

Cxcl11

Cxcl12

Fibrose

Inflammation

Lateral flow immunoassay

Ast

Cxcl10

Cxcl11

Cxcl12

Fibrose

Inflammation

Résumé

Introduction : Les maladies hépatiques sont un fléau à échelle mondiale avec plus de 844 millions de personnes atteintes. Les étiologies aigües, bien que rares, peuvent prendre une forme gravissime menant à la mort. Les hépatites chroniques représentent la très grande majorité des atteintes à l’échelle mondiale. Bien qu’elles soient un enjeu comparable à d’autres affections chroniques comme le diabète ou les maladies cardiovasculaires, elles demeurent insuffisamment diagnostiquées principalement car ce sont des maladies asymptomatiques. Le processus diagnostic repose actuellement sur l’établissement d’un bilan sanguin puis, en cas d’anormalité et de facteurs de risques associés, d’évaluation de l’étendue de la fibrose et de l’activité nécro-inflammatoire intrahépatique par biopsie hépatique. Pour se substituer à cette pratique invasive, de nombreuses méthodes alternatives émergent dont le Fibroscan. Le nouveau paradigme consiste à associer plusieurs marqueurs non invasifs afin d’accumuler suffisamment de preuves pour augmenter la précision diagnostique et notamment des marqueurs d’inflammation. Dans ce contexte, les chimiokines CXCL10, CXCL11 et CXCL12 qui interviennent dans des évènements chimiotactiques sont des candidats intéressants comme marqueurs d’inflammation ou de fibrose intrahépatique dans le cadre d’affections aigües ou chroniques. Objectif : D’une part, l’objectif de cette thèse a consisté à caractériser ces candidats biomarqueurs sur des cohortes humaines d’affections aigües ou chroniques. D’autre part, l’objectif a été de proposer un nouvel outil pour le dépistage simplifié et délocalisé des maladies hépatiques au travers de la technologie d’immunochromatographie par flux latéral. Patients et Méthode : La caractérisation des biomarqueurs candidats a consisté à mesurer le niveau sérique de ces chimiokines et de les corréler à des étiologies particulières dans le contexte d’affections aiguës ou de données clinico-biologiques de fibrose ou d’inflammations intrahépatiques dans le cadre d’affections chroniques. L'étude sur les atteintes aiguës a concerné 163 patients classés en fonction de l'étiologie. Pour les affections chroniques, l’étude a été menée sur deux étiologies : l’hépatite chronique causée par le virus de l’hépatite C (VHC) (n = 87) et l’alcoolisme chronique (n = 166). Concernant le développement d'un test rapide, une preuve de conception sur la forme cytosolique de l'enzyme AST a été réalisée pour démontrer l'équivalence du dosage entre la méthode de référence (mesure enzymatique) et la méthode développée (mesure immunologique). Pour cela, le dispositif développé a été évalué sur des patients (n = 23) ainsi que sur des sujets en bonne santé (n = 11) afin d'évaluer la spécificité du dispositif. Résultats : Les résultats obtenus sur les patients avec hépatites aigües ont permis d’aboutir à une signature chimiokinique en fonction de l’étiologie. Concernant le VHC, les résultats montrent que CXCL11/CXCL12 sont des biomarqueurs de cirrhose et CXCL10/11 des biomarqueurs d’inflammation intrahépatique. Pour les patients avec alcoolisme chronique, CXCL11 et CXCL12 sont associés également avec la fibrose avancée. De plus, elles sont corrélées à d’autres marqueurs non-invasifs de fibrose hépatique et sont également associés à la présence d’une stéatohépatite. Enfin, le test rapide développé démontre une bonne spécificité et sensibilité sur les échantillons évalués. De plus, une linéarité de mesure est obtenue permettant d’envisager un usage quantitatif avec un lecteur de test adapté. Conclusion : Ces travaux ont permis de caractériser de nouveaux biomarqueurs et de proposer de nouveaux outils pour l’amélioration du diagnostic des maladies hépatiques. De plus, les résultats obtenus soulèvent des questions sur les implications de ces chimiokines dans le processus pathogène des différentes étiologies étudiées et pourraient constituer, le cas échéant, de nouvelles cibles thérapeutiques.

Introduction: Liver diseases are a burden worldwide with more than 844 million people affected. Acute etiologies, though rare, can take a very serious form leading to death. Chronic hepatitis accounts for the vast majority people affected. Although they are an issue comparable to other chronic conditions such as diabetes or cardiovascular diseases, they remain underdiagnosed mainly because they are asymptomatic. The diagnosis process is currently based on the establishment of a blood test and, in case of abnormalities and associated risk factors, the evaluation of fibrosis extent and intrahepatic inflammatory activity by liver biopsy. To replace this invasive practice, many alternative methods emerge including Fibroscan. The new paradigm involves the association of multiple non-invasive markers in order to accumulate enough evidence to increase the accuracy, including markers of inflammation. In this context, the chemokines CXCL10, CXCL11 and CXCL12 which are involved in chemotactic events are interesting candidates as markers of inflammation or intrahepatic fibrosis in the context of acute or chronic conditions. Aim: On the one hand, the objective of this thesis was to characterize these biomarker candidates on human cohorts of acute or chronic conditions. On the other hand, the aim was to propose a new tool for the simplified and delocalized screening of liver diseases through lateral flow immunochromatography technology. Patients and method: The characterization of biomarker candidates consisted in measuring the serum release of these chemokines and correlating them to particular etiologies in the context of acute affections or to clinico-biological data of fibrosis or intrahepatic inflammation in the setting of chronic conditions. The study on acute conditions involved 163 patients classified according to the type of insult. Regarding chronic conditions, the study was carried out on two etiologies: chronic hepatitis caused by hepatitis C virus (n = 87 patients) and chronic alcoholism (n = 166 patients). Regarding the development of a rapid test, we chose to carry out a proof of concept on the enzyme cytosolic form of AST to demonstrate the equivalence of dosage between the reference method which consists of measuring the enzymatic activity and the method based on an immunological detection developed here. The device developed was evaluated on patients (n = 23) whose AST concentrations cover a wide concentration range as well as on healthy subjects (n = 11) to assess the specificity of the device. Results: The results obtained on patients with acute hepatitis have led to a chemokine patterns depending on the etiology. Regarding the HCV, the results show that CXCL11 / CXCL12 are biomarkers of cirrhosis and CXCL10 / 11 biomarkers of intrahepatic inflammation. For patients with chronic alcoholism, CXCL11 and CXCL12 are also associated with advanced fibrosis. In addition, they are correlated with other non-invasive markers of liver fibrosis and are also associated with the presence of steatohepatitis. Finally, the rapid test developed demonstrated good specificity and sensitivity on the samples evaluated. In addition, a linearity of measurement is obtained allowing to consider a quantitative use with a suitable test reader. Conclusion: This thesis allowed to characterize new biomarkers and to propose new tools for liver diseases diagnosis improvement. In addition, the results obtained raise questions about the implications of these chemokines in the pathogenic process of the different etiologies studied and could constitute, where appropriate, new therapeutic targets.