Etude biochimique et structurale de deux enzymes de thiolation des ARNt dépendantes d’un centre [4Fe-4S] : la s2U54-ARNt thiolase TtuA et la s2U34-ARNt thiolase NcsA

Structural and functional study of two enzymes [4Fe-4S] cluster dependant involved in tRNA thiolation : s2U54-tRNA thiolase TtuA and s2U34 tRNA thiolase NcsA

• Auteur / Autrice : Louise Bimai
• Direction : Béatrice Golinelli-Pimpaneau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 20/11/2018
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie des processus biologiques (Paris ; 2014-....) - Laboratoire de Chimie des Processus Biologiques
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Collège de France (1530-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie-Christine Maurel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Béatrice Golinelli-Pimpaneau, Marie-Christine Maurel, Marc Graille, Marc Fontecave, Carine Tisné, Mohamed Atta
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Graille

Mots clés

Mots clés libres

Fer-Soufre

Fer-Soufre

Modification

Iron-Sulfur

Modification

Trna

Résumé

Les ARN de transfert (ARNt) sont des composants essentiels de la machinerie de traduction génétique. Pour être fonctionnels, ces ARNt subissent des modifications chimiques post-transcriptionnelles. Ces modifications permettent d’améliorer la reconnaissance entre l’ARNt et ses partenaires durant la traduction et assurent ainsi la fidélité et l’efficacité de la traduction. Le soufre est présent dans plusieurs nucléosides au sein de ces ARNt, comme dérivé de la thiouridine (s4U8, s2U34, m5s2U54), de la 2-thioadénosine (ms2i6A37, ms2t6A37) et la 2-thiocytidine (s2C32).Mon projet a consisté en l’étude structurale et fonctionnelle de la famille d’enzymes TtcA/TtuA, une superfamille dépendante d’un centre [FeS] impliquée dans la thiolation des ARNt.La thiolation de la méthyl-uridine universellement conservée à la position 54, catalysée par l’enzyme TtuA, stabilise les ARNt de bactéries thermophiles et d’archées hyperthermophiles et est nécessaire pour la croissance à haute température de ces organismes. La thiolation de l’uridine en position 34 dans la boucle de l’anticodon, qui est nécessaire pour une croissance normale et la résistance aux stress chez la levure, est effectuée par deux systèmes complètement différents : la protéine MmnA qui a été bien étudiéE et est présente chez les bactéries et les mitochondries des organismes eucaryotes et les protéines NcsA/NcsA/Ctu1 dans tous les autres organismes, dont le cytoplasme des eucaryotes.Des études spectroscopiques, cristallographique et des tests d’activité de TtuA et NcsA ont montré que : (i) le centre [4Fe-4S] est coordonné par seulement trois cystéines qui sont entièrement conservées, permettant au quatrième fer de fixer du sulfure exogène, qui agit probablement comme agent sulfurant ; (ii) le site de fixation de l’ATP est adjacent au centre [4Fe-4S]. Un nouveau mécanisme de sulfuration des ARNt a été proposé, dans lequel l’atome de fer non liant du centre [4Fe-4S] catalytique fonctionne comme transporteur de soufre, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives sur la fonction des centres [Fe-S] en biologie.

Transfer RNAs are essential components of cellular translation machinery. To achieve their function they possess several post-transcriptional chemical modifications. These modifications improve recognition between tRNA and its partners during translation and thus ensure translation fidelity and efficiency. Sulfur is present in several of these modified nucleosides: as thiouridine and its derivatives (s4U8, s2U34, m5s2U54), 2-thioadenosine derivatives (ms2i6A37, ms2t6A37) and 2-thiocytidine (s2C32).My project consisted in the structural and functional study of enzymes of the TtcA/TtuA family a [4Fe-4S]-dependent superfamily, involved in the thiolation of transfer RNAs (tRNAs).My aim was to show that enzymes that catalyze the simple non-redox substitution of the C2-uridine carbonyl oxygen by sulfur at position 54 (TtuA) and 34 (Ncs6/Ctu1/NcsA) in tRNAs use an iron-sulfur cluster cofactor and elucidate the biochemical and structural mechanisms of the TtuA and NcsA reactions.The thiolation of the universally conserved methyl-uridine at position 54, catalyzed by TtuA, stabilizes tRNAs from thermophilic bacteria and hyperthermophilic archaea and is required for growth at high temperature of these organisms. On the other hand, the thiolation of uridine 34 in the anticodon loop of tRNAs, which is required for normal growth and stress resistance in yeast, is carried out by two completely different systems: the well-studied MnmA protein (present in bacteria and in the eukaryotic mitochondrion) and the Nsc6/NcsA/Ctu1 proteins in all other organisms, including the eukaryotic cytoplasm.Spectroscopic and crystallographic analysis, together with activity tests enzymatic of TtuA and NcsA showed that: (i) the [4Fe-4S] cluster is ligated by three cysteines only that are fully conserved, allowing the fourth unique iron to bind an exogenous sulfide, which likely acts as the sulfurating agent; (ii) the ATP-binding site is adjacent to the cluster. A new mechanism for tRNA sulfuration was proposed, in which the unique iron of the catalytic [4Fe-4S] cluster functions as a sulfur carrier, opening new perspectives regarding functions of iron-sulfur cluster in biology.