Deciphering exocytosis : kinetic analysis of fusion pore development and its associated secretory release

par Lihui Hu

Thèse de doctorat en Chimie Analytique

Sous la direction de Christian Amatore et de Jérôme Delacotte.

Le président du jury était Fethi Bedioui.

Le jury était composé de Christian Amatore, Jérôme Delacotte, Fethi Bedioui, Sabine Szunerits, Neso Sojic, Elisabeth Lojou.

Les rapporteurs étaient Sabine Szunerits, Neso Sojic.

  • Titre traduit

    Exocytose : analyse de la cinétique du développement du pore de fusion et de la libération sécrétoire associée


  • Résumé

    L'exocytose, la dernière étape du processus de sécrétion, a été étudiée sur des cellules neuroendocrines modèles (PC12). Nous avons caractérisé l'internalisation d'un analogue synthétique de neurotransmetteur (FFN102) dans les vésicules des cellules PC12. La différence de potentiel d'oxydation de la dopamine et de ce faux neurotransmetteur fluorescent a été exploitée pour montrer que l'internalisation de FFN102 s'effectue en remplaçant 10% de la dopamine endogène présente dans les vésicules. De plus, la cinétique de libération de FFN102 suggère son stockage dans un compartiment de la vésicule où sa diffusion est facilitée. Cette sonde électroactive et fluorescente associée aux cellules PC12 constitue donc un système de choix pour des études bioanalytiques impliquant la libération de neurotransmetteurs par exocytose. L'exocytose débute par la formation d'un pore formé par la fusion de la membrane vésiculaire avec la membrane de la cellule. Les mécanismes de régulation de l'expansion du pore de fusion ne sont pas complètement connus. Nous avons montré que la myosin II limite la vitesse d'expansion du pore en détectant la libération de la dopamine par ampérométrie et en traitant les cellules PC12 avec un inhibiteur pharmacologique. La mesure de la cinétique d'ouverture du pore à l'aide d'un modèle développé récemment a montré que la myosin II ne modifie pas la taille maximale du pore au cours de la libération de neurotransmetteurs. Ce suivi ampérométrique de l'expansion du pore est limité à une durée de quelques dizaines de millisecondes. Afin d'étendre la durée du suivi de l'expansion du pore, nous avons réalisé des mesures simultanées de libération de la dopamine par ampérométrie et d'évolution de la membrane vésiculaire par TIRFM. La membrane des vésicules a été marquée par des protéines fluorescentes sensibles au pH et génétiquement encodées. Nous avons pu ainsi observer l'évolution du pore qui s'achève par une fermeture ou une expansion complète. La quantité de neurotransmetteurs détectée était plus importante dans le cas d'une expansion totale du pore.


  • Résumé

    Exocytosis, the last step of the secretion process was investigated using the PC12 neuroendocrine cell model. We characterized the uptake of FFN102, a synthesized analog of neurotransmitter, in the secretory vesicles of PC12 cells. Relying on the different oxidation potentials of dopamine and FFN102, it was shown that FFN102 replaces ca. 10% of the dopamine stored in the vesicles. The release kinetics of FFN102 suggests that its storage occurred in a fast diffusion compartment of the vesicles. This electroactive fluorescent probe associated with the PC12 appears therefore as a valuable system for bioanalytical studies related to neurotransmitters release. Exocytosis starts when vesicular and cellular membranes fuse and lead to the formation of the fusion pore. The regulation mechanisms of the fusion pore expansion are not completely known. We have shown that myosin II slowed down the pore expansion using amperometric detection of released dopamine and inhibiting myosin II in PC12 cells treated with a pharmacological drug. A recently introduced model was used to measure the pore expansion kinetics and show that myosin II did not affect the extent of pore opening during neurotransmitter release. This monitoring of fusion pore expansion only span the tens milliseconds timescale. Simultaneous monitoring of both released dopamine using amperometry and stained vesicular membrane using TIRFM achieved to track the whole exocytotic events. The vesicular membrane was stained with genetically encoded pH-sensitive tagged proteins. Both “full opening” and closure of the pore were observed. The amount of released neurotransmitters was higher when the pore fully opened.


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