La sélénoprotéine T en tant que nouveau modulateur cardiaque : de la production à la mesure de l'expression et aux implications pathophysiologiques

Selenoprotein T as a novel cardiac modulator : from production to expression measurement and pathophysiological implications

• Auteur / Autrice : Carmine Rocca
• Direction : Youssef Anouar, Tommaso Angelone
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 02/03/2018
• Etablissement(s) : Normandie en cotutelle avec Univertà della Calabria (Rende, Italia)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Neuroendocrine EndOcrine and GeRminal DIfferentiation and Communication (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime ; 2022-....) - Différenciation et communication neuronale et neuroendocrine
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Jury : Président / Présidente : Angelo Corti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Youssef Anouar, Tommaso Angelone, Angelo Corti, Laurent Yon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yannick Goumon, Corrado Poggesi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glutathion peroxydase

Antioxydants

Protection

Cardiomyocytes

Sélénoprotéine T

Mots clés libres

Sélénoprotéine T

SELENOT

Dommages myocardiques

Antioxydants endogènes

Enzymes catalase

Superoxyde dimustase

Glutathion peroxydase

Selenoprotein T

SELENOT

Myocardial damage

Endogenous antioxidants

Catalase enzymes

Superoxide dimustase

Glutathione peroxidase

Résumé

Les sélénoprotéines représentent une classe particulière d’enzymes contenant du sélénium et caractérisée par une réactivité chimique spécifique. Ces systèmes protéiques agissent comme des capteurs redox intercellulaires et sont largement reconnus comme médiateurs essentiels pour la prévention de maladies, y compris les pathologies cardiovasculaires. Parmi ces protéines, la sélénoprotéine T (SelT ou SELENOT) est une nouvelle enzyme localisée au niveau du réticulum endoplasmique (ER) appartenant à la famille des rédoxines, dont la suppression de gène chez la souris est associée à une létalité embryonnaire précoce. A travers son domaine catalytique redox (Cys-X-X-Sec), la SelT exerce une action antioxydante e cytoprotective essentielle au niveau cérébral durant l’embryogenèse et suite à des lésions tissulaires. De nombreuses études ont démontré l’implication de la SelT via son activité redox, dans les processus du différentiation et protection des cellules nerveuses et endocrines dans des conditions physiopathologiques spécifiques. En revanche, rien n’est connu sur l’expression et la fonction du cette protéine dans d’autres organes vitaux comme le coeur, un tissus physiologiquement sujet à un stress oxydatif élevé, surtout après un dommage d’ischémie- réperfusion (I/R).Les études actuelles montrent un grand intérêt pour les molécules capables de réduire le stress oxydatif qui représente un des facteurs majeurs impliqués dans la pathogenèse des dommages myocardiques de l’I/R.Plusieurs études ont démontré les effets bénéfiques au niveau cardiaque des antioxydants endogènes spécifiques tels que les enzymes catalase, superoxyde dimustase et glutathion peroxydase sur les coeurs isolés soumis à l’I/R. Dans ce contexte, les antioxydants exogènes incluant les substances contenant des groupements thiols, exercent une action protectrice significative contre le déséquilibre redox typique des lésions myocardiques induites par l’I/R (kalaycioglu et al., 1999; khaper et al., 1997).A la lumière de ces observations, mon projet de thèse de doctorat a eu pour but de développer un immunodosage spécifique de la SelT et d’évaluer les implications physiopathologiques au niveau cardiovasculaire d’une forme de SelT recombinante (rSelT) et de son peptide dérivé PSELT (SelT 43-52) synthétisé chimiquement dans sa forme réduite, qui comprend le domaine catalytique redox Cys-Val-Ser-Sec.• La première partie du travail a eu pour but de:- optimiser la surexpression d’une forme recombinante de SelT de souris dans les cellules de E. coli,- calculer l’activité enzymatique exercée par la protéine pure.• Le second but du cette thèse a été:- le développement de deux essais spécifiques ELISA. En utilisant la protéine recombinante rSelT et un antisérum polyclonal de lapin contre rSelT, respectivement comme antigène et anticorps primaire, des dosages ELISA compétitif indirect (I-ELISA) pour évaluer les titres d’anticorps et indirect (C-ELISA) pour quantifier les niveaux des SelT solubles ont été mis au point.• La troisième partie du ce projet a eu pour objectif de:- déterminer l’expression de la SelT durant l’ontogenèse cardiaque et après un dommage ischémique ex vivo induit sur le coeur de souris adultes.- évaluer l’effet cardioprotecteur exercé par la rSelT et PSELT en tant qu’agents pharmacologiques en post-conditionnement contre les dommages de l’I/R dans un modèle de coeur isolé de souris perfusé selon le méthode de Langendorff.

Selenoproteins represent a particular class of selenium-containing enzymes with specific chemical reactivity, functioning as intracellular redox sensors; these proteins are increasingly recognized as essential mediators for disease prevention, including cardiovascular pathologies. Among these proteins, Selenoprotein T (SelT or SELENOT) is a novel thioredoxin-like endoplasmic-reticulum (ER) enzyme whose genetic ablation in mice results in early embryonic lethality. SelT exerts an essential antioxidant and cytoprotective action in the brain duringdevelopment and after injury, through its redox active catalytic site (Cys-X-X-Sec). Although a large body of evidence has now been accumulated showing that SelT affects, via its redox activity, the differentiation, function, the protection of nervous and endocrine cells in pathophysiological conditions, nothing is known about the expression and function of SelT in other vital organs such as the heart, which is normally severely exposed to oxidative stress, particularly as in the case of ischemia/reperfusion (I/R) damage. Therefore, the present doctoral project aimed to investigate, in a rat heart model, the pathophysiological cardiovascular implications of a recombinant form of SelT (rSelT) and its derived-peptide PSELT (SelT43-52), chemically synthetized in its reduced form, which encompasses the key redox Cys-Val-Ser-Sec motif, and to evaluate the possible application of rSelT for the development of a specific immunoassay.In the first part of the work, the production of a recombinant form of full-lenght rat SelT (rSelT) was optimized in E. coli cells; for this purpose, the cDNA corresponding to rat SelT was amplified from PC12 cells and cloned into the pGEM-T vector, and the protein was expressed as a His-tag fusion protein in E. coli. rSelT was purified under denaturing conditions and simultaneously renatured on-column by affinity chromatography.Purified rSelT was detected as a protein band corresponding to the molecular weight of about 23 kDa. Re-folded rSelT exhibited a thioredoxin reducatase (TrxR)-like enzymatic activity comparable to that of a control rat liver TrxR, dependent on the Cys/Sec residues of the thioredoxin-like fold, as demonstrated by the ability of a selective inhibitor (aurothiomalate) to abrogate the enzymatic activity of both rSelT and TrxR.