Modélisation de l'épithélium bronchique par les cellules souches pluripotentes induites humaines dans la Bronchopathie Pulmonaire Chronique Obstructive (BPCO)

Modeling modifications of airway epithelium in COPD

• Auteur / Autrice : Engi Ahmed
• Direction : John De Vos
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 29/10/2018
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut en médecine régénératrice et de biothérapie (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Pascal Chanez
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : John De Vos, Pascal Chanez, Serge Adnot, Anne Dubart-Kupperschmitt, Arnaud Bourdin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Serge Adnot, Anne Dubart-Kupperschmitt

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches pluripotentes induites

Tabac

Épithélium

Bronchopneumopathies obstructives

Mots clés libres

BPCO

Cellules pluripotentes humaines induites

Épithélium bronchique

Tabac

Modélisation

Copd

Human iPS

Bronchial epithelium

Cigarette smoke

Modeling disease

Résumé

La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologique.

COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening.