Détermination de la constante de dissociation de l'hybridation ADN / ADN aux interfaces solide/liquide par trois techniques différentes : résonance de plasmon de surface, biopuce par mesure de cartographie de fluorescence et par mesure de fluorescence par champ évanescent

Determination of dissociation constant of DNA/DNA hybridization by three different surface techniques : comparison of surface plasmon resonance, fluorescent microarray and evanescent field fluorescence

• Auteur / Autrice : Muchen Li
• Direction : Yann Chevolot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie pour le vivant
• Date : Soutenance le 16/10/2018
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Électronique, électrotechnique, automatique (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École Centrale de Lyon (1857-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Nanotechnologies de Lyon (Ecully, Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Yoann Roupioz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yann Chevolot, Thomas Gehin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yoann Roupioz, Anne Chantal Gouget-Laemmel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fluorescence

Biopuces

Mots clés libres

Hybridation d'ADN

Constante de dissociation

Résonance de plasmon de surface

Biopuce

Fluorescence

Fluorescence par champ évanescent

Chimie de surface

DNA hybridization

Dissociation constant

Surface plasmon resonance

Fluorescent microarray

Evasnescent field fluorescence

Surface chemistry

Résumé

Les biocapteurs sont des outils de détection et d'analyse puissants qui ont été largement utilisés dans les domaines de la santé, de la recherche biomédicale et de l’environnement. Cependant, différents biocapteurs utilisent différents transducteurs qui varient par la nature des substrats utilisés et par la chimie de surface. Tous ces paramètres peuvent avoir un effet sur les réactions biomoléculaires aux interfaces et conduire à des variations de la mesure de la constante de dissociation Kd. Dans ce contexte, ce travail de thèse visait à comparer trois techniques différentes : biopuce avec une détection par fluorescence, biocapteur à fluorescence par champ évanescent et biocapteur par résonance de plasmon de surface (SPR). Ces trois techniques ont été comparées pour la détermination de la constant de dissociation de l'hybridation de l'ADN. Pour la biopuce à fluorescence classique, le substrat est une lame de verre et la mesure est effectuée à la fin de l'expérience. Dans le cas du biocapteur à fluorescence à champ évanescent, le polystyrène est le substrat et une détection en temps réel est réalisée. La SPR est réalisée sur un film d'or mince. C'est une technique en temps réel et sans marquage. Les deux techniques basées sur la fluorescence nécessitent de marquer les cibles avec un fluorophore avant la mesure. Un facteur important déterminant la performance de l'analyse est la chimie de surface du capteur. Ici, nous avons optimisé la chimie de la surface de l'or pour le greffage d'ADN modifié thiol. Nous avons étudié deux méthodes de nettoyage: la solution de piranha et le plasma d'oxygène, dans le but d'obtenir une surface d'or propre sans oxydation de l'or. Ensuite, nous avons optimisé les paramètres lors de la mesure SPR comme par exemple la structure interfaciale du capteur, la force ionique .... Enfin, ces trois techniques ont été utilisées pour mesurer la constante de formation du duplex ADN/ADN. Les résultats ont montré que les Kd sont du même ordre de grandeur pour les trois techniques. De plus, pour les trois techniques, une augmentation de la densité de sonde de surface a entraîné une baisse d’affinité telle que mesurée.

Biosensors are powerful detection and analysis tools that have been widely applied in pharmaceuticals, healthcare, biomedical research, and environmental monitoring. However different biosensors use different transducers and therefore different substrates and surface chemistries. All of these parameters may have an effect on the biomolecular reactions at the interface and lead to a deviation in dissociation constant Kd measurements. In this context, this PhD work aimed at comparing three different techniques: fluorescent microarray, evanescent field fluorescence biosensor and surface plasmon resonance (SPR) biosensor, to determine DNA hybridization Kd. For the classical fluorescence microarray, the substrate is a glass slide and the detection is performed at the end of the experiment. In the case of evanescent field fluorescence biosensor, polystyrene is the substrate and it permits a real-time detection. SPR is performed on thin gold film. It is a real-time and a label-free technique. The two fluorescent based techniques require to label the targets with fluorescent dyes prior to the measurements. One important factor determining the performance of the analysis is the surface chemistry of the sensor chip. Herein, we have optimized gold surface chemistry for thiol modified DNA grafting. We studied two cleaning methods: piranha solution and oxygen plasma, aiming at obtaining a clean gold surface without oxidation of the gold. Then, we optimized SPR assay parameters such as interfacial structure of sensor chip, ionic strength... After, these three techniques were used to measure the DNA hybridization Kd. The results showed that the Kds measured are similar for the three techniques. In addition, increasing surface probe density resulted in an increase of Kd of DNA hybridization.