L'ingénierie protéique moderne : de l’évolution moléculaire dirigée à la conception rationnelle de biomolécules à intérêt diagnostique et vaccinal

Modern protein engineering : from directed molecular evolution to rational design of biomolecules with diagnostic and vaccine interest

• Auteur / Autrice : Priscillia Lagoutte
• Direction : Bettina Werle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 06/09/2018
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Bioaster
• Jury : Président / Présidente : Bernard Verrier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bettina Werle, Bérangère Bihan-Avalle, Hélène Baubichon-Cortay
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Luc Lenormand, Philippe Minard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Encapsulation (chimie)

Technologie des protéines

Ligands (biochimie)

Nanoparticules

Mots clés libres

Ribosome display (RD)

Échafaudage moléculaire

Ligands protéiques

NGS

Encapsuline

Nanoparticule

Plateforme de présentation et vectorisation

Ribosome display (RD)

Protein scaffold

Binders

NGS

Encapsulin

Nanoparticle

Display and vectorization platform

Résumé

L’ingénierie protéique servant autrefois à comprendre les relations structures-fonctions des protéines connait un tournant majeur depuis plusieurs années. L’ingénierie protéique évolue pour créer des nouvelles fonctions protéiques : c’est la naissance de l’ingénierie protéique moderne. L’objectif de ma thèse a consisté à mettre en place et caractériser deux approches indépendantes d’ingénierie protéique dans le domaine du vaccin et du diagnostic. Le premier projet consistait à générer des ligands protéiques à partir d‘échafaudages moléculaires (des alternatifs aux anticorps) en couplant le ribosome display au NGS et en développant des outils d’analyses bio-informatiques. Des sélections contre des cibles protéiques d’origine bactérienne et virale ont conduit à l’identification de ligands Affibodies affins (µM au nM). Leur caractérisation a validé leur potentiel comme outil de recherche et de réactif diagnostique. Ces études ont permis de valider la plateforme de génération des ligands mise en place, en augmentant l’exploration de l’espace de diversité des interactions des ligands. Le second projet portait sur le développement d’une plateforme de présentation et de vectorisation à partir de particules d’encapsuline. Elles ont été génétiquement modifiées pour présenter de manière répétée à leur surface l’ectodomaine de la protéine de matrice M2 (M2e) du virus Influenza A H1N1 tout en encapsulant une protéine hétérologue : l’eGFP. Les nanoparticules modifiées sont correctement formées et encapsulent l’eGFP. Des souris immunisées par ces particules induisent une réponse anticorps spécifique contre l’épitope M2e et l’eGFP. L’utilisation de ces nanoparticules comme plateforme vaccinale de présentation et de vectorisation est prometteuse et ouvre la voie pour d’autres applications en biotechnologie

In the past, protein engineering used to understand function and structure relationship. But since few years, protein engineering was used to create new protein functions: modern protein engineering was born. The aim of my thesis was to set up and characterize two approaches of protein engineering in diagnostic and vaccine field. The first project was to generate artificial binder using protein scaffolds as an alternative to antibodies by coupling ribosome display (RD) to NGS and developing bio-informatics tools. Screening and selection against bacterial and viral targets have led to affibody binder’s identification with an affinity range from µM to nM. Their characterization has validated their potential as research tools and protein reagents for diagnostic assay. Coupling ribosome display to high throughput sequencing as means to directly identify selected binder coding sequences, enormously enhance binder discovery depth. The second project was to generate an innovative nanocarrier based on encapsulin nanoparticle, for customized peptide display and cargo protein vectorization. Encapsulin particles from T.maritima were genetically modified for simultaneous display of the matrix protein 2 ectodomain of the influenza H1N1 A virus and heterologous protein eGFP packaging. Genetically engineered encapsulin nanoparticles were well-formed and abled to efficiently load eGFP. Immunogenicity studies revealed antibody responses against both the surface epitope and the loaded cargo protein. Taken together, this display system is a versatile tool for rational vaccine design and paves the way for new applications in the research fields of vaccine, antimicrobial research and other biotechnological applications