Diversity of fungal DyP-type peroxidases and their potential contribution to organic matter degradation

par Martino Adamo

Thèse de doctorat en Écologie microbienne

Sous la direction de Roland Marmeisse et de Mariangela Girlanda.

Soutenue le 31-05-2018

à Lyon en cotutelle avec l'Università degli studi (Torino, Italia) , dans le cadre de École Doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation , en partenariat avec Université Claude Bernard (Lyon) (établissement opérateur d'inscription) et de Écologie Microbienne Lyon (laboratoire) .

Le président du jury était Luca Cocolin.

Le jury était composé de Roland Marmeisse, Mariangela Girlanda, Marie-Noëlle Rosso, Yvan Moënne-Loccoz, Gianluca Corno.

Les rapporteurs étaient Andrea Franzetti, Mélanie Morel.

  • Titre traduit

    Diversité des péroxydases fongiques de la famille DyP et leur contribution potentielle à la dégradation de la matière organique


  • Résumé

    La lignine est un des polymères naturels les plus abondants sur la terre particulièrement résistant à la dégradation du fait de sa structure particulière qui lui permet de participer au renforcement des parois végétales ainsi qu'à la protection de celles-ci contre l'attaque de pathogènes. Peu d'organismes peuvent dégrader efficacement la lignine et la plupart de ceux-ci appartiennent au Règne Fongique. Dans la plupart des cas la dégradation des composants de la paroi végétale est réalisée par des enzymes sécrétées. Des études récentes soulignent combien l'arsenal enzymatique des champignons est intéressant dans plusieurs domaines :- nombreuses de ces enzymes sont déjà utilisées en biotechnologies dans de nombreux et divers processus industriels,- grâce à la possibilité de comparer les génomes de nombreuses espèces fongiques, au travers de l'étude des gènes impliqués dans la matière organique il apparait que l'évolution fongique et l'écologie de ces microorganismes sont étroitement liés,- les champignons dégradateurs de la matière organique végétale sont les principaux décomposeurs en milieu terrestre. Ils contribuent notamment de manière décisive dans le cycle biogéochimique du carbone en milieu forestier tempéré et boréal. L'étude et une meilleure compréhension des flux de carbone est importante pour mieux appréhender les phénomènes de changements climatiques.L'appareil enzymatique fongique permettant la dégradation de la matière organique est composé de dizaines, sinon de centaines d'enzymes aux rôles bien décrits pour certaines. Mais pour d'autres, leurs rôles restent à définir. C'est le cas des peroxydases de type DyP, une famille enzymatique découverte récemment et déjà bien connue dans le domaine des biotechnologies, étant capables de catalyser de nombreuses réactions. Leurs rôles dans la nature sont toutefois incertains. Il a été suggéré qu'elles puissent jouer un rôle dans la dégradation de la lignine, mais certaines études suggèrent plutôt un rôle de détoxification durant la dégradation de la biomasse.Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à mettre en lumière les rôles potentiels joués par ces enzymes. La famille des DyP a récemment été divisée en sous-groupes, mais pour ce qui concerne les DyP fongiques, il n'existait pas d'analyse approfondie de leur évolution phylogénique. Un tel travail nous a conduit à mettre en lumière l'existence ignorée jusqu'à présent de DyP aussi bien intracellulaires qu'extracellulaires.Afin d'améliorer nos connaissances sur cette famille enzymatique nous nous sommes orientés sur des analyses écologiques pour lesquelles nous avons dû au préalable développer des outils appropriés tel qu'un protocole d'extraction d'ARN à partir de bois en décomposition.Par une approche d'écologie moléculaire, nous avons évalué quelle est la source et la diversité des champignons producteurs de DyP dans 3 habitats distincts : des sols forestiers, des sols de prairies et du bois en décomposition.Une analyse par métabarcoding des communautés fongiques de ces environnements a au préalable été réalisée et a démontré le bénéfice que l'on peut tirer en métabarcoding de l'analyse comparative de l'ADN et de l'ARN environnemental pour une description optimale de ces communautés.L'étude de la diversité des DyP exprimées au sein des communautés fongiques présentes dans ces différents habitats a été réalisée par capture de séquences à partir d'ARN environnementaux.Les résultats préliminaires obtenus démontrent la capacité de l'approche expérimentale à isoler les gènes pleine longueur correspondants de tous les échantillons étudiés. Certaines de ces DyP environnementales ont été transformées dans le champignon Podospora anserina, et l'expression de l'une d'entre elle dans ce système hétérologue a pu être démontrée [etc...]


  • Résumé

    Lignin is one of the most abundant natural polymers on earth whose resistance to degradation contributes to the mechanical strength of plant cellwalls and protects plant cells from pathogen attack. Few organisms are candegrade lignin efficiently; most of them belong to the fungal Kingdom. Inmost cases, plant cell wall degradation results from enzymatic attack. Recent studies also underline the contribution of secreted fungal enzymes in many areas:- many of these enzymes are already in use in numerous industrial processes,- thanks to the comparison between fungal genomes, through the study ofgenes implicated in organic matter degradation, it becomes obvious that fungal evolution and their ecology are two tightly linked phenomena,- saprotrophic fungi degrading organic matter are the main decomposers in terrestrial ecosystems. Among other, they contribute in a decisive way tothe carbon biogeochemical cycle in temperate and boreal ecosystems. Thestudy and a better comprehension of carbon fluxes are of prime importance in the evaluation of climate changes.The fungal enzymatic machinery involved in organic matter decomposition is compozed of dozens of enzymes whose functions are diversely understood. The roles of several of them need to be clarified. This is the case for the DyP peroxidases, an enzyme family recently described but already well known in the field of biotechnology for their capacity of catalyzing many reactions. Their natural role in natural ecosystems are however matter of discussion. It has been suggested that they could participate in lignin degradation although a role in detoxification during biomass degradation cannot be excluded.In the course of this thesis, we highlighted the potential roles of these enzymes.The DyP gene family had been divided in different sub-families but nostudy specifically dealt with the phylogeny of fungal DyPs. Such an analysis revealed the unsuspected existence of both intracellular and extracellular DyPs in fungi. To better understand the potential roles of this fungal gene family we developed ecological analyses that first required the development of specific tools such as a protocol to extract RNA directly from decomposing wood. Following a molecular ecology approach, we evaluated the source and diversity of DyP-producing fungi in three distinct habitats; grassland soils, forest soils and decomposing wood. A metabarcoding analysis of the fungal communities present in these different environments has first been conducted and has revealed the beneficial impact of performing metabarcoding on both environmental DNA and RNA to accurately describe fungal communities.The study of DyPs expressed within fungal communities colonizing these different habitats has been conducted by sequence capture on environmental RNA. Preliminary results demonstrate the validity of this approach to isolate the corresponding full-length genes from all studies environmental samples. Several of these environmental DyP genes were transformed in the fungus Podospora anserina and the expression of one of them in this heterologous host was demonstrated.In conclusion, DyP peroxidases still represent a family of fungal enzymes of unclear role. We suggest that extracellular and intracellular DyPs may play complementary roles in both lignin degradation and detoxification of toxic environmental compounds, respectively. This enzyme family is more specifically present in the genomes of basidiomycete fungi capable of enzymatic deconstrustion of lignin. A restricted number of DyP genes has been isolated from each of the different studied environmental samples, thus suggesting that the corresponding enzymes are not abundantly produced although present in all environments


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