Analyses biochimiques et fonctionnelles de protéines cibles de POFUT1

Biochemical and functional analyses of POFUT1 target proteins

• Auteur / Autrice : Florian Pennarubia
• Direction : Abderrahman Maftah, Sébastien Legardinier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 14/12/2018
• Etablissement(s) : Limoges
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Biologiques et Santé (Limoges ; 2018-2022)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des Agroressources, Biomolécules et Chimie pour l'Innovation en Santé (Limoges ; 2018-)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Michel Petit
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amalia Trousson
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Tony Lefebvre, Mohamed Ouzzine

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycomique

Mots clés libres

POFUT1

O-fucosylation

EGF-like

WIF1

CuAAC

Résumé

La O-fucosylation, catalysée par Pofut1, est une glycosylation rare qui consiste en l’ajout d’un fucose O-lié sur la sérine ou la thréonine d’une séquence consensus (C2X4(S/T)C3), portée par un domaine EGF-like (ELD) d’une glycoprotéine membranaire ou sécrétée. Notre analyse de la lignée murine Pofut1cax/cax, hypomorphe pour le gène Pofut1, a révélé une hypertrophie musculaire post-natale associée à une diminution du pool de cellules satellites. Ce phénotype est en partie associé à un défaut d’interaction entre les récepteurs NOTCH hypo-O-fucosylés des myoblastes dérivés de cellulessatellites (MDCS) et leurs ligands DSL, ce qui aboutit à une plus faible activation de la signalisation Notch. D’autres protéines potentiellement impliquées dans la myogenèse peuvent également être la cible de POFUT1. C’est notamment le cas de la protéine Wnt inhibitory factor 1 (WIF1), qui dispose de cinq ELDs, dont deux sont potentiellement aptes à recevoir un O-fucose (ELDs III et V). Par une approche phylogénétique, nous avons montré la conservation de ces deux sites de O-fucosylation et de deux sites de N-glycosylation chez la plupart des bilatériens. Nos expériences démontrent l’occupationde tous ces sites, excepté le site de O-fucosylation de l’ELD V, chez la protéine WIF1 murine. La capacité de l’ELD III, produit de manière isolée, à recevoir un fucose O-lié a été démontrée après O-fucosylation in vitro, par l’association de cycloaddition azide-alcyne assistée au cuivre (CuAAC) et de spectrométrie de masse en mode MRM. Cette nouvelle approche expérimentale a par la suite été standardisée et sa sensibilité évaluée en comparant deux autres ELDs (ELDs 12 et 26 de NOTCH1) connus pour être O-fucosylés mais présentant des affinités différentes pour POFUT1. De façonsurprenante, l’ELD V de WIF1 ne peut être O-fucosylé, probablement en raison d’un clash stérique entre cet ELD et POFUT1, prévenant ainsi leur interaction. L’analyse de la protéine WIF1 entière a confirmé les résultats obtenus sur les ELDs isolés et démontre l’occupation des deux sites de N-glycosylation. Enfin, nos résultats montrent également l’importance de ces deux N-glycanes, mais également celle du O-fucose de l’ELD III, pour une sécrétion optimale de la protéine WIF1 murine.

The, Pofut1-catalyzed O-fucosylation, is a rare glycosylation which consists of the addition of an O-linked fucose to the serine or threonine of a consensus sequence (C2X4(S/T)C3), carried by an EGF-like domain (ELD) of a membrane or secreted glycoprotein. Our analysis of the murine line Pofut1cax/cax, hypomorphic for the Pofut1 gene, revealed post-natal muscle hypertrophy associated with a decrease in the satellite cell pool. This phenotype was partly associated with a lack of interaction between hypo-O-fucosylated NOTCH receptors of satellite cell-derived myoblasts (SCDM) and their DSL ligands, which resulted in a lower activation of Notch signaling. Other proteins potentially involved in myogenesis may also be the target of POFUT1. This is indeed the case for the protein Wnt inhibitory factor 1 (WIF1), which has five ELDs, whose only two are potentially able to receive an O-fucose (ELDs III and V). Using a phylogenetic approach, we showed in most bilaterians that these two O-fucosylation sites and two N-glycosylation sites were conserved. Our experiments showed theoccupation of all these sites, except for the O-fucosylation site of murine WIF1 protein ELD V. The ability of the ELD III, produced as an isolated protein, to receive O-linked fucose was demonstrated after an in vitro O-fucosylation by combination of copper-catalysed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and MRM-mass spectrometry. This new experimental approach was then standardized and its sensitivity was evaluated by comparing two other ELDs (NOTCH1 ELDs 12 and 26) known to beO-fucosylated but with different affinities for POFUT1. Surprisingly, WIF1's ELD V could not be O-fucosylated, probably due to a steric clash between this ELD and POFUT1, thus preventing their interaction. The analysis of the full-length WIF1 protein confirmed our results obtained with isolated ELDs and demonstrated the occupation of the two N-glycosylation sites. Finally, our results also showed the importance of these two N-glycans, but also the importance of ELD III’s O-fucose, foroptimal secretion of the murine WIF1 protein.