Identification de phosphatases agissant sur la régulation de la phosphorylation de la « Leucine-Rich Repeat Kinase 2 », une kinase impliquée dans la maladie de Parkinson

Identification of protein phosphatases that act on the phosphoregulation of Leucine-Rich Repeat Kinase 2, a kinase implicated in Parkinson’s disease

• Auteur / Autrice : Matthieu Drouyer
• Direction : Jean-Marc Taymans
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 20/12/2018
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Jean-Pierre AUBERT Neurosciences et Cancer (Lille) - Centre de Recherche Jean-Pierre AUBERT Neurosciences et Cancer - U1172 Inserm - U837

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lentivirus

Phosphorylation

Holoenzymes

Leucine-rich repeat serine-threonine protein kinase-2

Dissertation universitaire

Maladie de Parkinson

Lentivirus

Phosphorylation

Protéines phosphatases

Maladie de Parkinson

Mots clés libres

LRRK2

Phosphorylation

Phosphatases

PLA

CRISPR-Cas9

Ovocyte de Xénope

Lentivirus

Phosphorégulation

Leucine-Rich Repeat Kinase 2

Phosphosite cluster

Phosphatases

Proximity Ligation Assay

CRISPR-dCas9

Résumé

Le gène codant la Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) compte parmi les déterminants génétiques les plus importants de la maladie de Parkinson (MP). Les mutations de LRRK2 sont parmi les plus fréquentes de la MP. La protéine LRRK2 est une protéine hautement phosphorylée dont les sites de phosphorylation hétérologues (S910/S935/S955/S973) sont déphosphorylés dans le tissu cérébral de patients sporadiques, en présence de certains mutants pathogènes de LRRK2 et après un traitement avec des inhibiteurs de la fonction kinase de LRRK2, une thérapie potentielle de la MP. Par ailleurs, cette déphosphorylation est accompagnée d’une augmentation de l’interaction avec la phosphatase PPP1CA et une perte de liaison avec la protéine 14-3-3. Ces observations indiquent qu’il existe un déséquilibre de la phosphorylation de LRRK2 dans la MP et que les phosphatases joueraient un rôle important dans la régulation de cette protéine. Les protéines phosphatases PP1 et PP2A sont des holoenzymes composées de sous-unités catalytiques et régulatrice et la composition précise des holoenzymes de phosphatases actives sur LRRK2 n’est pas connue. L'objectif de ce travail de thèse était de déterminer la composition précise des holoenzymes phosphatases régulant la phosphorylation de LRRK2.Ce travail s’appuie sur un criblage par génétique inverse des phosphatases effectué préalablement,qui a permis de définir un nombre de phosphatases candidates comprenant des sous-unités de PP1et PP2A. Nous avons dans un premier temps étudié l’interaction fonctionnelle entre LRRK2 et les différentes sous-unités de phosphatases candidates par des techniques d’immunocytochimie dans les cellules HEK-293T en conditions basales et de déphosphorylation. Un travail collaboratif nousa permis de réaliser une cinétique de déphosphorylation de LRRK2 après micro-injection de la phosphatase PP2A dans des ovocytes de Xénope. Enfin, le développement et l’utilisation de la technologie CRIPSR-dCas9 ont permis de moduler l’expression endogène des différentes sous unités composant les holoenzymes dans des cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y.Les analyses de co-localisation et de Proximity Ligation Assay (PLA) ont permis de d’observer un recrutement des sous-unités de PP1 et PP2A dans le même compartiment cellulaire que LRRK2.De plus, l’interaction entre LRRK2 et les sous-unité PPP1CA, PPP2CA, PPP2R2A et PPP2R2Best augmentée en condition de déphosphorylation. Nous avons ensuite montré que les combinaisons PPP2CA:PPP2R2A et PPP2CA:PPP2R2B déphosphorylaient efficacement LRRK2sur le site S935 par rapport à la condition contrôle et la condition PPP2CA seule et ce dès 30minutes. Dans les cellules SH-SY5Y, la modulation de l’expression endogène des phosphatases a confirmé l’importance des sous-unités régulatrices de PP1 et PP2A, respectivement PPP1R1B etPPP2R2A dans la régulation de la phosphorylation de LRRK2.En conclusion, ce travail de thèse a permis de confirmer l’implication de PP1 et révéler le rôle dePP2A dans la régulation de la phosphorylation de LRRK2. Nous avons démontré que l’holoenzymePPP2CA:PPP2R2A/B est un régulateur physiologique de LRRK2. Ces informations sont donc très utiles pour mieux comprendre la cascade de signalisation de la protéine LRRK2, un déterminant génétique clef de la MP.

Mutations in the gene encoding Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) are one of the most common genetic causes of Parkinson’s disease (PD). LRRK2 is a highly phosphorylated protein and one particular phosphosite cluster (S910/S935/S955/S973) is dephosphorylated in several disease mutant forms of the protein, in sporadic PD brain tissue and upon LRRK2 inhibitortreatment, considered as a potential therapeutic approach. Interestingly, dephosphorylation of thephosphosites of the LRRK2 N-terminal region in the presence of LRRK2 PD mutations orinhibition of LRRK2 led to similar changes in LRRK2 complexes such as loss of 14-3-3 bindingand increased binding of PPP1CA. This indicates that phosphatases play an important role inLRRK2 cellular regulation. PP1, like PP2A, functions solely as a multimeric enzyme (a.k.a.holoenzyme) consisting of a catalytic and a regulatory subunit, and does not function as free monomers in eukaryotic cells. Therefore, the aim of this study is to validate candidate phosphatases regulating the LRRK2 phosphorylation cycle. This work is based on a previous phosphatome-widereverse genetics screen, revealing LRRK2 phosphorylation regulators linked to the PP1 and PP2Aholoenzyme complexes. We first analyzed functional interaction of LRRK2 with candidatephosphatases by immunofluorescence microscopy in HEK-293T cells, under basal anddephosphorylation conditions. In a collaborative work, we also injected Xenopus oocytes withcombinations of PP2A phosphatase for a kinetic analysis of LRRK2 dephosphorylation.Endogenous expression of selected candidate LRRK2 phosphatases was modulated using lentiviralvector and CRISPR-dCas9 technology in SH-SY5Y neuroblastoma cells.A close association of LRRK2 with a subset of candidate catalytic and regulatory subunits of PP1and PP2A was observed. Moreover, LRRK2 preferentially interacts with PPP1CA as well as PPP2CA, PPP2R2A and PPP2R2B under dephosphorylation conditions. Our kinetic analysis in aphysiological system showed an increase of dephosphorylation of LRRK2 at S935 when the PP2Aholoenzyme was completed with PPPR2RA or PPP2R2B regulatory subunits compared toconditions with PPP2CA injection alone or the buffer control. In SH-SY5Y cells, modulation ofendogenous expression of phosphatases confirmed the importance or regulatory subunits PPP1R1Band PPP2R2A of PP1 and PP2A respectively in regulating LRRK2 phosphorylation.In conclusion, this thesis work both confirmed a role for PP1 and revealed a role for a specificPP2A holoenzyme, denoted PPP2CA:PPPR2RA/B in LRRK2 phosphoregulation. These scientificdata are therefore relevant to better understand the LRRK2 signaling cascades, a key genetic contributor in PD.