Développement d’un système rapporteur générique sensible, au double mode de lecture BRET/HCS, pour l’étude du suivi de gènes rapporteurs, de l’activité de protéase virale et des interactions protéine-protéine

Development of a sensitive generic reporter system, BRET/HCS dual-reading mode for gene reporter tracking, viral infection and protein-protein interaction monitoring

• Auteur / Autrice : Béatrice Colin
• Direction : Cyril Couturier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du médicament
• Date : Soutenance le 27/09/2018
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et Molécules pour agir sur les Systèmes Vivants (Lille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gènes rapporteurs

Maladies virales

Dissertation universitaire

Techniques de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence

Protéases

Interactions protéine-protéine

Viroses

Bioluminescence

Mots clés libres

BRET

Tobacco Etch Virus protéase

Protéase TEV

Infection virale

Gène rapporteur

Interaction protéine-protéine

Bioluminescence Resonance Energy Transfer

BRET

HCS

High Content Screening

Transfection

Viral infection

Reporter gene

Protein-protein interaction

Résumé

De nombreux systèmes rapporteurs ont été développés pour répondre à différentes applications allant de l’étude des régions promotrices gouvernant l’expression de gènes au suivi de voies de signalisation ou encore à l’interaction de partenaires protéiques.Dans le but initial de développer un test d’activité protéase ayant une sensibilité accrue, nous avons mis au point un système rapporteur permettant l’amplification du signal en développant un système basé sur l’utilisation d’une enzyme relais hyperactive, la protéase TEV (Tobacco Etch Virus) qui vient couper une sonde protéique cible. La détection du signal se fait par deux modes de lecture compatibles avec le haut débit et conduit à un signal de type ON/OFF. Le transfert d’énergie de bioluminescence par résonance (BRET), permet de mesurer un signal à l’état basal, qui diminuera après clivage de la sonde par la protéase TEV. La microscopie de fluorescence à haut contenu ou HCS (High Content Screening) permettra d’observer le changement de localisation de la fluorescence de l’accepteur fluorescent de la sonde utilisée dans le transfert d’énergie, du noyau vers le cytoplasme des cellules, différenciant ainsi les cellules positives des négatives.Ainsi, la grande sensibilité de notre système nous a amené à valider son utilisation de façon générique, en optimisant dans un premier temps la sonde BRET/HCS à la base du test par une série de délétions dans le but d’obtenir le meilleur transfert d’énergie possible, en délétant des acides aminés à l’extrémité C-terminale de l’accepteur et N-terminale du donneur d’énergie. Le contraste entre les deux états a également été amélioré afin de faciliter la lecture en HCS, en testant différentes séquences de localisation nucléaire. Grâce à cette nouvelle sonde, plusieurs preuves de concept dans des domaines variés ont pu être démontrées telles que i) le suivi de l’infection virale avec pour modèle l’infection par le virus de l’Hépatite C (HCV) ii) le suivi de l’expression de gènes rapporteurs avec comme modèle le récepteur TGR5 couplé aux protéines G, impliqué dans le diabète ainsi que iii) la détection d’interactions protéine/protéine avec pour modèle de développement l’interaction entre les protéines FRB et FKBP12 induite par la rapamycine. Les résultats réunis lors de cette thèse ont permis le développement d’un nouveau système rapporteur d’une sensibilité accrue utilisable dans différentes applications biologiques.

Several reporter systems have been developed in order to support fundamental scientific projects, from gene promoter regulation study, signaling pathway activation, or protein/protein interaction monitoring.In order to enhance the sensitivity of a protease assay, we developed a new reporter system allowing signal amplification by optimizing a system based on the use of a hyperactive relay enzyme from Tobacco Etch Virus (TEV protease). The signal is detected by two methods compatible with high-throughput and leads to an ON/OFF signal. The Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to measure a signal at basal state, which will decrease upon cleavage of the probe by the protease. High Content Screening (HCS) Microscopy also allows the differentiation between positive and negative cells by a simple shift in the fluorescence acceptor location of the probe used in energy transfer, from the nucleus to the cytoplasm of the cells.The high sensitivity of our approach now leads us to validate its use in a more generic way. This is why the project aimed at the optimization of the BRET probe at the origin of the test, by performing a serie of amino acid deletions at the N-terminus of the energy donor and the C-terminus of the energy acceptor to find the best probe in order to obtain the best energy transfer. The HCS contrast between the two states was aslo increased by testing different nuclear localization sequences. With this new probe, we tried to adapt the system to several fields of application like i) a viral infection test using the HCV protease as a proof of concept but also ii) the expression of a reporter gene with the TGR5, a G-coupled protein receptor as model and iii) the detection of protein-protein interactions. To demonstrate this concept, we used the well know interaction between FRB and FKBP12 proteins, induced by rapamycine. Results from this project will lead to the development of a new reporter system, auto-amplified and usable in a generic way, which a very high sensitivity is necessary.