Sélection de fragments d’anticorps dirigés contre les microcystines pour la mise au point de tests d’immunodétection

Selection of microcystins antibody fragments for the development of immunodetection assays

• Auteur / Autrice : Rita Maalouf
• Direction : Séverine Padiolleau-Lefèvre, Philippe Billiald
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie : Unité de recherche Génie Enzymatique et Cellulaire - GEC (FRE-3580)
• Date : Soutenance le 30/05/2018
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génie Enzymatique et Cellulaire / GEC

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance plasmonique de surface

Diagnostic immunologique

Immunodosage

Technique immunoenzymatique

ELISA

Cellules -- Hybridation

Toxines

Antigènes

Anticorps monoclonaux

Anticorps

Microcystines

Cyanobactéries

Mots clés libres

Cyanotoxines

Heptapeptides

Cyanobacteria

Microcystin

Phage display

Single chain fragment variable

Surface plasmon resonance

Antibodies

ELISA

Résumé

Les cyanobactéries sont des micro-organismes qui préoccupent les autorités de santé publique dans le monde entier, en raison de la toxicité des cyanotoxines qu'elles produisent. Certaines cyanotoxines dont les microcystines (MC) sont des hépatotoxines inhibitrices de protéines phosphatases à sérine/thréonine. Aujourd'hui, plus de 200 variants de MCs ont été identifiés. Il s'agit d'heptapeptides monocycliques synthétisés par voie non-ribosomale dont la MC-LR (cyclo- (D-Ala-L-Leu-D-érythro-β-méthylAsp-L-Arg-ADDA-D-Glu-N-méthyl-hydro-Ala) est le variant le plus étudié en raison de sa fréquence et de sa forte toxicité. L’objectif de cette étude est le développement d'une méthode d'immunoanalyse rapide, sensible et fiable pour détecter les MCs. Le projet vise donc à développer un outil alternatif de détection de la MC-LR, qui serait mieux adapté aux analyses sur le terrain que les méthodes analytiques, biologiques ou les méthodes d'inhibition d'activité enzymatique actuellement disponibles. L'originalité de ce projet réside dans l'utilisation de deux approches différentes pour sélectionner de nouveaux anticorps spécifiques de la MC-LR. La première repose sur l'immunisation d'animaux de laboratoire, la technologie d'hybridation cellulaire et la sélection d'hybridomes sécréteurs d'anticorps monoclonaux. Si la méthodologie mise en œuvre a effectivement permis d'obtenir des immun-sérums spécifiques, la sélection des hybridomes d'intérêt reste à optimiser. La seconde stratégie mise en œuvre est basée sur la technologie du phage display pour sélectionner des fragments d'anticorps spécifiques de MC-LR à partir d'une banque de taille d’environ 109 phages, exprimant en surface des anticorps sous un format scFv (Shahsavarian et al., 2014). Plusieurs méthodes de criblage ont été développées et trois scFv ont été sélectionnés et étudiés, parallèlement à un quatrième scFv identifié dans une étude précédente (McElhiney et al., 2002), tous spécifiques à la MC-LR. Ces scFv ont été produits sous forme libre, soluble et leur spécificité à la MC-LR a été évaluée par ELISA et résonance plasmonique de surface. Les résultats obtenus montrent que les scFv sélectionnés sont tous capables de reconnaître la MC-LR. Néanmoins, ces résultats sont peu reproductibles et remettent en question le protocole de renaturation utilisé. Un travail de fond sur l’optimisation du protocole de renaturation s’avèrerait nécessaire pour les scFv ici sélectionnés, afin d’identifier les paramètres précis aboutissant à la perte ou au gain de leur fonctionnalité.

Cyanobacteria are ubiquitous microorganisms that present a worldwide concern to public health authorities because of the toxicity of the cyanotoxins they produce. Some cyanotoxins are hepatotoxins such as microcystins (MCs). At least 200 variants of MCs have been identified till today. In our study, we focus on MC-LR, a monocyclic heptapeptide (cyclo-(D-Ala-L-Leu-D-erythro-β-methylAsp-L-Arg-ADDA-D-Glu-N-methyldehydro-Ala), since it is the most frequently detected and one of the most toxic. In our study, we are interested in developing a fast, sensitive and reliable method to detect MCs. The project aims to develop an alternative pollution detection method that would be better suited to field measurements than the physicochemical methods currently available. The originality of this project lies in the use of two different approaches to select a panel of antibodies suitable for the development of immunodetection tests. The first one is based on the hybridoma technology for the production of monoclonal antibodies. The second one is based on phage display technique to select antibody fragments that are specific to MC-LR from a library of approximately 109 phages, expressing on the surface scFv fragments (Shahsavarian et al., 2014). Two monoclonal antibodies were selected using the first approach, and their specificity was evaluated using ELISA technique. Along with three scFvs selected from phage display approach. An additional scFv was added to this list: 3A8, selected from a previous study (McElhiney et al., 2002) and also specific to MC-LR. The scFvs were cloned into an expression vector in order to get each clone in its scFv soluble form. Then, their specificity to MC-LR was evaluated using ELISA technique and Surface plasmon resonance. The results show a potential specificity to MC-LR. Nevertheless, these results are not very reproducible and call into question the refolding protocol used. A thorough work on this protocol optimization would be necessary, in order to find the key parameters that control the loss or gain of their functionality