Adaptation to high hydrostatic pressure : disruption of a hydrogenase gene clusters in a piezo-hyperthermohilic archaeon Thermococcus barophilus
Génétique et génomique des microorganismes piézophiles des sources hydrothermales océaniques profondes : adaptation aux hautes pressions hydrostatiques chez l'archée piézo-hyperthermophile : Thermococcus barophilus, apport de la génétique et impact des hydrogénases
Résumé
The deep sea representing a significant portion of the terrestrial biosphere but still very little studied and many questions remain about organisms that live in this ecosystems including their diversity and adaptibility. At this depth Hydrostatic pressure is the major physical parameter. In this study, physiological adaptations to HHP were investigated after genetic deletion of hydrogenase clusters in T.barophilus. This archea piezo-hyperthermophilic was isolated at 3550m from a hydrothermal vent site; indeed, previous transcriptomic experimented have highlighted the over-expression of genes encoding hydrogenases under sub and supra-optimal HHP using the recent genetic system available for this archaeon. This gene disruption system is based on single and double crossover events to obtain makerless deletion mutants and used simvastatin and 6-MP for selection and counterselection respectively. In this study we developped firstly a new way of selection for the genetic disruption system using 6-methylpurine for negative selection. This method was then used to delete two cytoplasmic sulfhydrogenases (SHI and SHII) and membrane bound hydrogenases (Mbh, Mbh-Codh, Mbx). Using 6-methylpurine for negative selection to inverted the rate of false positives pop-out clones from 80% obtained with 5-FOA to 10% and the first phenotypic studies of mutants strains under HHP show the impact of hydrogenase on culture growth and hydrogen production.
Dans cette étude, les adaptations physiologiques aux hautes pressions hydrostatiques ont été étudiées après délétion de groupes de gènes codant pour les hydrogénases chez Thermococcus barophilus. Cette archée piézo-hyperthermophile isolée au niveau du site hydrothermal "Snakepit" à 3 550 mètres de profondeur a pour pression optimale 40 MPa ; des études trancriptomiques antérieures ont mis en évidence la sur-expression de certains gènes codants pour les hydrogénases sous des conditions de pressions sub et supra optimales (0,1 et 70 MPa). Ici, nous essayons de déterminer le rôle précis de chaque enzyme dans l'adaptation aux HPH en utilisant l'outil génétique récemment développé au laboratoire chez cette archée. Ce système génétique repose sur un double évènement de recombinaison successif afin d'obtenir des mutants de délétion et sur l'utilisation de la Simvastatine et de la 6-méthylpurine (6-MP) comme marqueur de sélection. Cette méthode a ensuite été utilisée pour déléter deux sulfhydrogénases cytosoliques (SHI et SHII) et des hydrogénases membranaires (Mbh, Mbh-Codh et Mbx). L'utilisation de la 6-méthylpurine pour la sélection négative a considérablement diminué le nombre de faux positifs avec un taux de 30% contre 80% obtenu avec le 5-FOA l'ancien marqueur de sélection négatif. Les premières études phénotypiques des souches mutantes sous haute pression hydrostatique confirment le rôle majeur des hydrogénases.
Origine : Version validée par le jury (STAR)