Identification et caractérisation de bilirubines oxydases pour l'élaboration de biopiles enzymatique à glucose/oxygène

Identification and characterization of bilirubin oxidases for enzymatic glucose/oxygen biofuel cell elaboration

• Auteur / Autrice : Elodie Roussarie
• Direction : Nicolas Mano
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 01/10/2018
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Zakri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cécile Zakri, Corinne Lionne, Loïc Blum, Claire Stines-Chaumeil, Sandrine Boschi-Muller, Jean Chaudière, Guy Perrière
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Corinne Lionne, Loïc Blum

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sel

Biopiles enzymatiques

Bilirubine oxydase

Mots clés libres

Bilirubine oxydase

Reconstruction ancestrale

NaCl

Mécanisme enzymatique

Phylogénie

Biopiles

Stabilité

Stopped flow

Bilirubin oxidase

Ancestral reconstitution

NaCl

Enzymatic mechanism

Phylogeny

Biofuel cells

Stability

Stopped-flow

Résumé

La puissance de la biopile enzymatique à glucose/oxygène est limitée par sa partiecathodique. Afin de contourner cette limitation, nous avons étudié les enzymescathodiques : les Bilirubine oxydases (BODs). Dans le but de mieux appréhender ces BODs, lemécanisme réactionnel, la nature de l’étape limitante et l’effet des sels ont alors été étudiés.Deux mécanismes différents sont retrouvés en fonction du mode de transfert des protons etdes électrons (4 fois 1H+/1e- ou 2 fois 2H+/2e-). De plus, nous avons démontré que l’étapelimitante est l’oxydation du substrat pour les trois substrats testés et que les sels agissent auniveau du cuivre T1. Les principales limitations des BODs sont leur stabilité à 37 °C ainsi queleur inhibition par le NaCl. Deux techniques ont alors été utilisées pour identifier des BODsplus résistantes. La première méthode est l’extraction de nouvelles enzymes à partird’organismes extremophiles. Elle a permis d’isoler la BOD d’Anaerophaga thermohalophilaqui possède une bonne résistance au NaCl mais une densité de courant faible. Dans unsecond temps, afin de reconstruire des séquences ancestrales, la phylogénie de la familledes Bacillus Bacterium a été effectuée. Cette technique a permis l’identification de troisBODs possédant des caractéristiques très intéressantes : la BOD de Bacillus nakamurai etdeux BODs ancestrales (Noeud 10 et Noeud 13). Par exemple, après une heure à 37°C et 140mM de NaCl, le Noeud 10 possède une meilleure densité de courant que la BOD de Bacilluspumilus, qui est l’enzyme utilisée comme base de la phylogénie. La seconde technique estdonc une méthode de choix permettant la découverte de nouvelles enzymes à la fois plusstables et plus résistantes que les enzymes actuelles. Elle ouvre de grandes perspectivespour l’utilisation des BODs comme enzymes cathodiques ou pour d’autres applicationsbiotechnologiques. Enfin, nous avons montré que l’immobilisation de la BOD de B. pumilusdans le matériau Si-(HIPE) permet la décoloration cyclique de colorants chimiques surplusieurs mois.

Power of glucose/oxygen enzymatic biofuel cell is limited by the cathodic part. In order to prevent this limitation, we studied cathodic enzymes: Bilirubin oxidases (BODs). For this purpose, the kinetic mechanism, rate-limiting step and salts effect were determined. Two different mechanisms are observed depending on the electron/proton transfer (4 times1H+/1e- or 2 times 2H+/2e-). We also demonstrated that the rate-limiting step is the substrate oxidation for the three substrates tested and salts act around the T1 copper. Main BODs limitations are their stability at 37°C and their inhibition by NaCl. Two methods were used toidentify the most resistant BODs. The first one was the identification of new enzymes from extremophile organisms. It allows to isolate BOD from Anaerophaga thermohalophila whichhas good NaCl resistance but low current density. In addition, in order to reconstructancestral sequences, phylogeny of Bacillus Bacterium family was performed. This methodidentified three BODs with interesting features: BOD from Bacillus nakamurai and twoancestral BODs (Noeud 10 and Noeud 13). For example, after one hour at 37°C and 140 mMNaCl, Noeud 10 has a better current density than the BOD from Bacillus pumilus, which is theenzyme used as basis for the phylogeny. This second method allowed the discovery of newenzymes that were both more stable and more resistant than actual enzymes. Thistechnique opens up valuable prospects for the use of BODs as cathodic enzymes or for otherbiotechnological applications. In the end, we demonstrated that BOD from B. pumilusimmobilization in Si-(HIPE) materials allows cyclic discoloration of chemical dyes duringseveral months.