Utilisation des pompes d'efflux dans l'ingénierie de la tolérance chez Deinococcus geothermalis

Use of efflux pumps in the engineering of tolerance in Deinococcus geothermalis

• Auteur / Autrice : Erika Boulant
• Direction : Jean-Michel Bolla
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Microbiologie
• Date : Soutenance le 19/12/2018
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la vie et de la santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Enveloppe bactérienne, perméabilité et antibiotiques (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Bleves
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sophie Bleves, Martin Picard, Joanna Timmins, Jean-Paul Leonetti, Emmanuelle Cambon, Wafa Achouak
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Martin Picard, Joanna Timmins

Mots clés

Mots clés contrôlés

Antibactériens

composition chimique

Paroi cellulaire

Microbiologie industrielle

Protéines de transport membranaire

Cocci à Gram positif

génétique

Deinococcus

Mots clés libres

Deinococcus

Pompes d'efflux

Ingénierie de la tolérance

Antibiotiques

Deinococcus

Efflux pumps

Engineering of tolerance

Antibiotics

Résumé

L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné.

The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased.