Role of rare calreticulin mutants and of the endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of myeloproliferative neoplasms

par Katte Rao Toppaldoddi

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Hématologie et oncologie

Sous la direction de William Vainchenker et de Cecil Ross.

Soutenue le 25-09-2017

à Sorbonne Paris Cité en cotutelle avec Saint John’s National Academy of Health Sciences (Bangalore, Inde) , dans le cadre de École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Hématopoïèse normale et pathologique (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-2019) (laboratoire) et de Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (établissement de préparation) .

Le président du jury était Nadine Ajzenberg.

Le jury était composé de William Vainchenker, Cecil Ross, Nadine Ajzenberg, Chloé James, Stefan Constantinescu, Loïc Garçon.

Les rapporteurs étaient Chloé James, Stefan Constantinescu.

mots clés

• Néoplasmes myéloprolifératifs
• Mutants de type-1
• Mutants de type-2
• IRE-1alpha
• Leucémie myéloïde chronique
• Protéines p53
• Réponse aux protéines mal repliées
• Calréticuline
• Thrombocytémie essentielle
• Myélofibrose primitive

Titre traduit

Rôle de mutants rares de la calréticuline et du stress du réticulum endoplasmique dans la pathogenèse des néoplasmes myéloprolifératifs

Résumé

Après la découverte des mutations de la calréticuline dans les néoplasmes classiques myéloproliferatifs négatifs pour le Ph1, les travaux se sont focalisés sur les deux mutations les plus fréquentes, c'est-à-dire la calréticuline del52 et l’ins5, mais il existe environ 20% de mutants rares de la calréticuline (une cinquantaine), qui ont été classés en type-1 « like » et type-2 « like », classification basée sur leur structure. Cependant il reste à déterminer si cette classification est pertinente du point de vue fonctionnel, ce qui pourrait avoir des conséquences pour la prise en charge des patients et leur traitement. Ici, nous démontrons que deux mutants rares de type-1 (del34 et del46) et un de type-2 (del19) se comportent de manière similaire aux deux mutations fondatrices de cette classification, del52 et ins5, respectivement. Ces résultats ont été validés par des expériences in vivo chez la souris. Tous les mutants de la calréticuline (del19, del34 et del46) nécessitent absolument le récepteur de la thrombopoïétine, appelé MPL, pour induire une transformation cellulaire en provoquant une activation indépendante de la thrombopoïétine de la voie MPL / JAK2-STAT, comme les mutants del52 et ins5. Dans les expériences de transplantation de moelle osseuse de souris, les mutants rares de type-1 sont associés à une progression fréquente de la maladie d’un tableau proche d’une thrombocytémie essentielle à une myélofibrose, tandis que le mutant rare de type 2 est associé à une légère thrombocytose. Du point de vue hématopoïétique, les mutants rares de type-1 provoquent une amplification au niveau des cellules souches hématopoïétiques donc à un stade précoce tandis que les mutants rares de type-2 provoquent une amplification tardive de la mégacaryopoïèse. Grâce à une modélisation protéique basée sur l'homologie des mutants de calréticuline, nous avons identifié des domaines oncogènes qui seraient potentiellement responsables de l'interaction pathologique de la calréticuline et de MPL pour conduire à une activation indépendante de la thrombopoïétine. Maintenant, ces résultats in silico doivent être absolument validés par des études structure fonction. Enfin, nous avons modélisé un nouveau mécanisme de signalisation dans la leucémie myéloïde chronique comprenant IRE-1alpha, un bras de la voie de réponse des protéines mal repliées (UPR), qui pourrait être responsable de la perte de la fonction de la p53 pendant la progression de la leucémie myéloïde chronique vers une leucémie aiguë. Un tel mécanisme pourrait être impliqué dans les autres MPN.

mots clés

• Calreticulin
• Myeloproliferative neoplasms
• Type-1 like mutants
• Type-2 like mutants
• Essential thrombocythemia
• Unfolded protein response (UPR)
• Myelofibrosis
• IRE-1alpha
• Chronic myeloid leukemia
• P53

Résumé

After the discovery of calreticulin mutations in classical Ph1- Myeloproliferative Neoplasms, extensive investigation is underway on the two most frequent mutations, i.e., del52 and ins5, but it remains that the rare calreticulin mutants, which include both type-1 like and type-2 like require a similar investigation for ascertaining whether the classification of type-1 and type-2 has a functional relevance as well as for therapeutic intervention and patient management. Here we demonstrate that type-1 like (del34 and del46) and type-2 like (del19) mutants behave similarly as del52 and ins5 mutants, respectively. Moreover, we validate our findings with in vivo experiments. All the calreticulin mutants (del19, del34 and del46) absolutely require the thrombopoietin receptor, MPL, to induce cell transformation by causing ligand independent activation of the MPL/JAK2-STAT pathway. In mouse bone marrow transplantation experiments, type-1 like mutants are associated with frequent progression from an essential thrombocythemia-like phenotype to myelofibrosis whereas type-2 like mutant is associated with mild thrombocytosis. Type-1 like mutants cause clonal amplification of early hematopoetic stem cells whereas the type-2 like mutant causes late platelet amplification. Further, by homology based protein modeling of calreticulin mutants, we have identified possible oncogenic domains responsible for pathologic interaction of CALR and MPL leading to ligand independent activation of MPL. Now they must be validated by structural-functional studies Finally, we have modelled a novel signaling mechanism in chronic myeloid leukemia comprising of IRE-1alpha, an unfolded protein response (UPR) pathway arm, which may be responsible for loss of the WT p53 function during leukemic development and progression. Such a mechanism may be involved in the other MPNs