Nouveaux modèles de lésion induite par étirement dans des oligodendrocytes et des tranches organotypiques de cervelet de souris : étude des mécanismes physiopathologiques

Novel models of stretch-induced injury in mouse oligodendrocytes and organotypic culture of cerebellar slices : study of pathophysiological mechanisms

• Auteur / Autrice : Elena Chierto
• Direction : Mehrnaz Jafarian-Tehrani
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 20/01/2017
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Toxicité environnementale, cibles thérapeutiques, signalisation cellulaire (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Fatiha Nothias
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Assaad A. Eid, François Rannou, Delphine Meffre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Catherine Coirault, Abdel Ghoumari

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stress oxydatif

Démyélinisation

Crâne -- Lésions et blessures

Oligodendrocytes

Mots clés libres

Oligodendrocytes

Traumatisme crânien

Mécano-Stimulation

Lésion induite par étirement

Démyélinisation

Stress oxydant

Culture organotypique de tranches de cervelet

Culture primaire enrichie en oligodendrocytes

Lignée oligodendrocytaire 158N

Oligodendrocytes

Traumatic brain injury

Mechanostimulation

Stretch-Induced injury

Demyelination

Oxidative stress

OrgaCulture organotypiquenotypic culture of cerebellar slices

Oligodendrocyte-Enriched primary culture

1Lignée oligodendroc5Lignée oligodendroc8N oligodendrocytes cell line

Résumé

Le traumatisme crânien (TC) engendre une déformation rapide, dû à un étirement ou une torsion, du tissu cérébral. Parmi les forces mécaniques, l'étirement est connu pour être une composante importante du TC. Comprendre comment ces forces et la mécano-stimulation conduisent à des dommages tissulaires reste un défi considérable. Le TC initie une cascade d'événements physiopathologiques secondaires, comme l'excitotoxicité, l'inflammation et le stress oxydant. De nombreuses évidences expérimentales suggèrent que la démyélinisation joue un rôle important dans la physiopathologie du TC. Notre hypothèse était basée sur le fait qu'une lésion traumatique induite par étirement puisse provoquer une démyélinisation. Le but de ma thèse était de développer des modèles innovants de lésion induite par étirement dans des oligodendrocytes et des tranches organotypiques de cervelet, tissu fortement myélinisé, afin d'élucider les mécanismes physiopathologiques, comme le stress oxydant, initiés après l'étirement. Au cours de mon doctorat, j'ai développé plusieurs modèles de lésion induite par étirement en utilisant i) la lignée oligodendrocytaire de souris 158N, ii) la culture primaire mixte de cellules gliales, iii) la culture primaire enrichie en oligodendrocytes et, iv) la culture organotypique de tranches de cervelet de souris. Les cellules ou les tranches ont été soumises à un étirement statique équibiaxial à l'aide de l'appareil Flexcell® Tension system afin de reproduire deux modèles de lésion induite par étirement : lésion "légère" (20%) versus "modérée" (30%). Mes travaux ont mis en évidence que la lésion "légère" i) diminue l'adhérence cellulaire et affecte la morphologie cellulaire avec une diminution de la surface des oligodendrocytes matures et immatures dans la culture primaire enrichie en oligodendrocytes, ii) induit une augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ERO), des protéines oxydées (AOPP) et une altération de l'expression des gènes pro-(DUOX-1) et antioxydants (SOD-1, SOD-2, HO-1, NQO-1, Nrf-2) dans la lignée cellulaire et dans la culture primaire mixte de cellules gliales, et iii) modifie l'expression des gènes de la myéline (PLP, MAG, CNPase) dans tous les modèles étudiés. L'étirement «modéré» induit dans les cellules une altération plus prononcée de l'état redox et un effet plus marqué sur la morphologie cellulaire avec une atteinte des ramifications dans la culture enrichie en oligodendrocytes. Les tranches cérébelleuses, soumises à un étirement «modéré», montrent une accumulation de protéine précurseur de l'amyloïde (APP), un marqueur de lésion axonale, et une altération de la morphologie des jonctions paranodales qui apparaissent allongées dans les tranches étirées. Une altération de l'expression des gènes pro- / antioxydants et des gènes de la myéline a été également observée. La lésion induite par étirement dans les tranches de cervelet provoque une atteinte axonale et myélinique, comparable à celle observée après un TC in vivo. En conclusion, des modèles in vitro de lésion induite par étirement ont été développés pour la première fois dans les oligodendrocytes et les tranches de cervelet. Mes travaux, montrant que l'étirement mécanique provoque la perte d'oligodendrocytes et la démyélinisation, soulignent l'importance de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la protection des oligodendrocytes. Ces modèles apparaissent pertinents pour l'étude des événements physiopathologiques qui se produisent après une lésion induite par étirement ainsi que pour le criblage rapide de composés thérapeutiques.

Traumatic brain injury (TBI) is caused by rapid deformation, stretching and tearing of the brain tissue. Among the mechanical forces, strain is known to be an important component of TBI. Understanding how the mechanical forces and mechanostimulation lead to tissue damage remains a considerable challenge. TBI initiates a cascade of secondary pathophysiological events, as excitotoxicity, inflammation and oxidative stress. Experimental evidences suggest that demyelination may play an important role in the pathophysiology of TBI. Our hypothesis was that stretch-induced traumatic injury may initiate demyelination. The aim of my PhD thesis was to develop innovative models of stretch-induced injury in oligodendrocytes and in organotypic cerebellar slices, rich in myelinated fibers, in order to decipher the pathophysiological mechanisms, such as oxidative stress, initiated following stretch. I developed several models of stretch-induced injury using i) the mouse oligodendrocyte cell line 158N, ii) the mixed glial primary culture, iii) the oligodendrocyte-enriched primary culture and finally, iv) the organotypic culture of cerebellar slices in mice. Cells or slices were subjected to an equibiaxial static stretch using Flexcell® Tension system device in order to reproduce two models of stretch-induced injury: "mild" (20% strain) versus "moderate" (30% strain) injury. Our results showed that the "mild" stretch i) decreased the cell adherence and affected the cell morphology with a decrease of surface area in both mature and immature oligodendrocytes in the oligodendrocyte-enriched culture, ii) induced an increase in reactive oxygen species (ROS) production, protein oxydation (AOPP), and an alteration in the expression of pro- (DUOX-1) and anti-oxidant genes (SOD-1, SOD-2, HO-1, NQO-1, Nrf-2) in the cell line and in the mixed glial primary culture, iii) modified the expression of the myelin genes (PLP, MAG, CNPase) in all studied models. The "moderate" stretch on cells induced a more pronounced alteration of the cellular redox status and a stronger effect on the cell morphology with a damage of cell ramifications in the oligodendrocyte-enriched culture. Cerebellar slices, subjected to a "moderate" stretch, showed an accumulation of amyloid precursor protein (APP), a marker of axonal injury, and an alteration of paranodal junctions morphology which appeared elongated. An alteration in the expression of pro- /anti-oxidant and myelin genes was also observed. Therefore, stretch-induced injury in cerebellar slices led to axonal and myelin injury, similar to what observed following TBI in vivo. In conclusion, several models of stretch-induced injury were developed for the first time in oligodendrocytes and cerebellar slices showing that mechanical stretch causes loss of oligodendrocytes and demyelination. These findings highlight the importance of developing therapeutic strategies based on oligodendrocyte protection. These models are relevant for studying the pathophysiological events that occur after stretch-induced injury as well as for rapid screening of therapeutic compounds.