Étude de la toxicité endothéliale de l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA) : implication des microvésicules endothéliales, de HMGB1 et de la PARP

Endothelial toxicity of recombinant tissue plasminogen activator : involvement of endothelial microvesicles, HMGB1 and PARP

• Auteur / Autrice : Kahina Khacef
• Direction : Isabelle Margaill
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie
• Date : Soutenance le 15/11/2017
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Pharmacologie de la circulation cérébrale / EA 4475
• Jury : Président / Présidente : Vincent Bérézowski
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Bérézowski, Carine Ali, Christine Marie, Eduardo R. Anglés-Cano, Virginie Beray-Berthat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carine Ali, Christine Marie

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thrombolyse

Poly (ADP-ribose) polymérase

Activateur tissulaire du plasminogène

Ischémie cérébrale

Maladies cérébrovasculaires

Mots clés libres

Accidents vasculaires cérébraux

Ischémie cérébrale

Activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA)

BEnd.3

Microvésicules endothéliales

Poly(ADP-Ribose) Polymérase (PARP) HMGB1

Stroke

Cerebral ischemia

Recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA)

BEnd.3

Endothelial microvesicles

HPoly(ADP-Ribose) mgb1

Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP)

Résumé

La thrombolyse par l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rt-PA) est actuellement le seul traitement pharmacologique approuvé dans la prise en charge des accidents vasculaires cérébraux d'origine ischémique. Cependant, sa fenêtre thérapeutique étroite (4h30) et ses nombreuses contre-indications limitent son utilisation. De plus, le rt-PA présente une toxicité vasculaire à l'origine de transformations hémorragiques (TH) responsables du décès précoce des patients. Notre équipe a retrouvé dans des modèles d'ischémie cérébrale réalisés chez la souris des TH spontanées qui sont aggravées par le rt-PA, et a montré l'implication de la poly(ADP-ribose)polymérase (PARP) dans ces effets. Dans ce contexte, l'objectif de mon travail a été de préciser les mécanismes impliqués dans la toxicité vasculaire du rt-PA, et plus particulièrement au niveau endothélial ; je me suis ainsi intéressée à deux entités : les microvésicules endothéliales (MVE) qui sont des marqueurs particulièrement novateurs de la dysfonction endothéliale, et l'alarmine HMGB1 (High Mobility Group Box 1). Nous avons montré in vitro sur une lignée de cellules endothéliales cérébrales murines (bEnd.3) par cytométrie en flux que le rt-PA, à la concentration de 40 µg/ml entraîne, via la plasmine, une libération importante de microvésicules endothéliales. Nous avons également mis en évidence l'implication de la PARP et de la voie des p38 MAPK dans cette production de MVE. En ce qui concerne HMGB1, nos résultats montrent que le rt-PA n'induit pas sa sécrétion par les cellules bEnd.3, mais modifie son état de solubilité. Après rt-PA en effet HMGB1 disparaît de la fraction contenant les protéines solubles du cytoplasme et du noyau et se retrouve dans une fraction qui contient les protéines insolubles du noyau, telles que les histones, ce qui suggère que HMGB1 est alors très fortement liée à la chromatine. Par ailleurs, nous avons mis en évidence in vivo dans un modèle d'ischémie cérébrale endovasculaire transitoire chez la souris des taux plasmatiques élevés de HMGB1 après ischémie, taux qui ne sont pas augmentés par le traitement par le rt-PA. En conclusion, l'ensemble de ces travaux a mis en évidence une production plasmine dépendante de MVE par le rt-PA, qui pourrait être impliquée dans ses effets délétères au niveau endothélial et vasculaire. D'autre part, les conséquences du changement de la localisation de HMGB1 induit par le rt-PA nécessite plus d'investigations afin de déterminer son éventuelle implication dans ses effets délétères. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettrait d'associer au rt-PA des stratégies afin de limiter sa toxicité et d'augmenter sa fenêtre thérapeutique.

Recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) is currently the only approved pharmacological strategy for acute ischemic stroke. However, its use remains limited due to its narrow therapeutic window (4h30) and its many contraindications. Moreover, rt-PA exhibits vascular toxicity that causes haemorrhagic transformations (TH), leading to premature death of patients. Our team has shown spontaneous TH in models of cerebral ischemia in mice, that are exacerbated by rt-PA, and the role of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in these effects. In this context, the aim of my thesis was to elucidate the mechanisms involved in the vascular toxicity of rt-PA, particularly at the endothelial level. In this work, I focused on two entities: endothelial microvesicles (EMV), which are particularly innovative markers of endothelial dysfunction, and the alarmin HMGB1 (High Mobility Group Box 1). We demonstrated in vitro in a murine cerebral endothelial cells line (bEnd.3) by flow cytometry that rt-PA, at the concentration of 40 µg/ml, enhances, via plasmin, the release of endothelial microvesicles. We also demonstrated the involvement of PARP and p38 MAPK in this production of EMV. Concerning HMGB1, our results show that rt-PA does not induce its secretion by bEnd.3 cells, but alters its solubility state. After rt-PA treatment, HMGB1 disappears from the fraction which contains the soluble proteins of the cytoplasm and the nucleus and is found in a fraction that contains the insoluble proteins of the nucleus, such as histones. These findings suggest that HMGB1 is strongly linked to chromatin. Our in vivo studies performed in a mouse model of transient cerebral ischemia showed an increase in plasma levels of HMGB1 that was not aggravated by rt-PA treatment. In conclusion, our results show that rt-PA induces the production of microvesicles by cerebral endothelial cells, through plasmin, which could be implicated in its deleterious effects at the endothelial and vascular levels. The consequences of the change in the solubility state of HMGB1 induced by rt-PA require more investigations in order to assess its possible involvement in its deleterious effects. A better understanding of these mechanisms could lead to new strategies to be associated to rt-PA to limit its toxicity and increase its therapeutic window.