Mise en place d’une approche protéomique en vue d’une application au diagnostic d’infections parasitaires congénitales

Implementation of a proteomic approach for an application of the diagnosis of congenital parasitic infections

• Auteur / Autrice : Alexandra Emmanuel
• Direction : Florence Migot-Nabias, Joëlle Vinh
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 26/09/2017
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Patrick Mayeux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Migot-Nabias, Joëlle Vinh, Patrick Mayeux, Yannis François, Christophe Masselon, Florence Gombert
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Yannis François, Christophe Masselon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Parasitoses

Série allélique

Polymorphisme génétique

Spectrométrie de masse

Protéomique

Immunoglobuline G

Mots clés libres

IgG

Polymorphisme

Protéomique

Middle-Down

NanoLC FT MS/MS

IgG

Polymorphism

Proteomic

Middle-Down

NanoLC FT MS/MS

Résumé

Au cours des deux dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) est devenue un outil incontournable dans la caractérisation des protéines comme les IgG. Ces anticorps assurent la protection de l'organisme contre les antigènes, qu'ils reconnaissent grâce aux domaines variables de leurs chaînes lourdes et légères. Des séquences polymorphes existent également au niveau des domaines constants CH2 et CH3 du fragment Fc, impliquant quelques acides aminés, qui définissent ainsi 34 allèles protéiques IGHG des 4 sous-classes d'IgG. Des relations sont établies entre certains de ces polymorphismes et la fonctionnalité de la réponse anticorps. La caractérisation du polymorphisme allélique des IgG par la MS est fréquemment effectuée par la stratégie bottom-up. Cette approche analytique repose sur l'analyse des protéines digérées par des endoprotéases classiques (comme la trypsine) générant des peptides protéolytiques (~30 acides aminés). Nous avons donc utilisé cette méthode combinée à des approches de biologie moléculaire pour étudier ce polymorphisme. Cependant la présence, pour un même individu, de plusieurs allèles d'homologie très forte limite la caractérisation spécifique des séquences de Fc. Dans ce contexte, nous avons développé une approche middle-down permettant d'analyser de grands fragments peptidiques (~ 211 acides aminés). IdeS est une endoprotéase spécifique des IgG qui génère spécifiquement deux fragments : les fragments Fc/2 et F(ab')2. Ces fragments sont alors étudiés par nanoLC-MS/MS à très haute résolution (140000 à m/z 200). La fragmentation des ions précurseurs a été réalisée en mode HCD (higher-energy collisional dissociation). Les données obtenues ont été traitées pour recherche dans les banques de données et les résultats ont été validés manuellement. Malgré la faible performance des logiciels disponibles à ce jour pour automatiser ce traitement, notre approche montre qu'il est possible de discriminer plusieurs allèles IGHG des différentes IgG. Au vu de la forte homologie de séquence il est important d'optimiser la couverture de séquence car certains allèles ne diffèrent que d'un résidu sur les 211 acides aminés séquencés. Cette preuve de concept des capacités d'une analyse middle-down pour identifier les différents Fc/2 pourrait à l'avenir être utilisée comme outil diagnostic pour la caractérisation des polymorphismes des Fc/2 dans un contexte de suspicion d'infections parasitaires congénitales.

Over the past two decades, mass spectrometry (MS) has become an essential tool in the characterization of proteins such as IgG. These antibodies protect the organism against antigens, which they recognize through the variable domains of their heavy and light chains. Polymorphic sequences also exist at the constant domains CH2 and CH3 of the Fc fragment, involving a few amino acids, which thus define 34 IGHG protein alleles of the 4 IgG subclasses. Relationships are established between some of these polymorphisms and the functionality of the antibody response. The characterization of allelic polymorphism of IgG by MS is frequently carried out by the bottom-up strategy. This analytical approach relies on the analysis of proteins digested by conventional endoproteases (such as trypsin) generating proteolytic peptides (~ 30 amino acids). We have therefore used this method combined with molecular biology approaches to study this polymorphism. However, the presence, for the same individual, of several alleles of very strong homology limits the specific characterization of the sequences of Fc. In this context, we developed a middle-down approach to analyze large peptide fragments (~ 211 amino acids). IdeS is an IgG-specific endoprotease that specifically generates two fragments: the Fc/2 and F (ab')2 fragments. These fragments are then studied by nanoLC-MS/MS at very high resolution (140000 at m/z 200). The fragmentation of the precursor ions was carried out in HCD (higher-energy collisional dissociation) mode. The data obtained were processed and searched in the databases and the results were validated manually. Despite the poor performance of the software available to date due to limited automation, our approach shows that it is possible to discriminate several IGHG alleles from different IgGs. In view of the high sequence homology it is important to optimize the sequence coverage because some alleles differ only by one residue over the 211 amino acids sequenced. This proof of concept of the capabilities of a middle-down analysis to identify different Fc/2 could be used in the future as a diagnostic tool for the characterization of Fc /2 polymorphisms in a context of suspicion of congenital parasitic infections.