Contrôle post-traductionnel de la sécrétion de Type III chez la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum : chaperonnes et protéine à domaine T3S4

Post-translational control of Type III secretion in the phytopathogenic bacterium Ralstonia solanacearum : chaperones and T3S4 protein

• Auteur / Autrice : Fabien Lonjon
• Direction : Fabienne Vailleau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions plantes-microorganismes
• Date : Soutenance le 25/09/2017
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des Interactions Plantes-Microbes-Environnement

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flétrissement bactérien

Ralstonia solanacearum

Mots clés libres

Flétrissement bactérien

Système de sécrétion de Type III (SST3)

Chaperonnes de Type III (CT3)

Régulation post-traductionnelle de la sécrétion de Type III

Bacterial wilt

Type 3 secretion system (T3SS)

Type 3 chaperone (T3C)

Type III secretion substrate specificity switch (T3S4)

Post translational regulation of type 3 secretion

Résumé

La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est lʼagent responsable du flétrissement bactérien sur plus de 200 espèces végétales, dont des espèces agronomiques, faisant de cette bactériose une des plus importantes dans le monde. Le pouvoir pathogène de la bactérie repose en grande partie sur sa capacité à injecter des protéines, appelées effecteurs de Type III (ET3), via le système de sécrétion de Type III (SST3). Chez R. solanacearum, les mécanismes de contrôle de la sécrétion au niveau post-traductionnel restent méconnus, contrairement aux mécanismes de régulation transcriptionnelle. Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés à quatre protéines potentiellement impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’ET3 au niveau post-traductionnel : les protéines chaperonnes de Type III (CT3) putatives HpaB et HpaD, la protéine à domaine LRR HpaG et la protéine à domaine T3S4 HpaP. Nous avons ainsi comparé les sécrétomes de la souche sauvage et des mutants hpa (hypersensitive response and pathogenicity associated) par spectrométrie de masse. Ces protéines ont des rôles très différents sur le contrôle de la sécrétion d’ET3. En effet, la protéine HpaG s’avère être un régulateur négatif de la sécrétion d’ET3 et est spécifiquement requise pour le développement de la maladie sur Medicago truncatula. Au contraire, la protéine HpaD contrôle la sécrétion de peu de substrats du SST3, mais est capable d’interagir avec 9 ET3. Enfin, la protéine HpaB est nécessaire à la sécrétion de la majorité des ET3 et interagit avec 10 ET3. Nos travaux nous ont permis de conclure que les protéines HpaB et HpaD sont de véritables chaperonnes de Type III de classe IB. La protéine HpaB est de plus nécessaire au pouvoir pathogène de la bactérie sur l’ensemble des hôtes testés. Nous avons montré que son homologue chez X. campestris pv. vesicatoria (Xcv) était capable de complémenter partiellement le mutant hpaB de R. solanacearum. Cela a permis d’illustrer le rôle central de la chaperonne HpaB dans la sécrétion d’ET3 chez R. solanacearum et Xcv. Concernant la protéine à domaine T3S4 HpaP, nous avons montré qu’elle contrôlait surtout la sécrétion de substrats précoces du SST3 et de très peu d’ET3. La protéine HpaP interagit physiquement avec la protéine HrpJ, composant putatif de la tige interne du SST3. Chez un mutant hpaP, la protéine HrpJ est alors spécifiquement sécrétée, transloquée in planta, puis retrouvée au sein du cytoplasme et du réticulum endoplasmique de la cellule végétale. Par des approches de génétique d’association, nous avons montré que la protéine HrpJ était capable de déclencher des réponses de type HR-like/nécrose sur certaines accessions d’A. thaliana, et que ces réponses semblaient liées à des acyl-transférases végétales. Nos travaux soulignent ainsi la complexité du réseau de régulation de la sécrétion d’ET3 chez R. solanacearum au niveau post-traductionnel, et ont permis d’avancer dans la compréhension du rôle des protéines Hpa dans ces mécanismes de régulation.

Ralstonia solanacearum species complex, causing bacterial wilt disease, exerts its pathogenicity through more than a hundred secreted proteins, many of them depending directly on the functionality of a type 3 secretion system (T3SS). To date, only few type 3 effectors (T3Es) have been identified as individually required for bacterial pathogenicity. In order to identify sets of effectors collectively promoting disease on susceptible hosts, we investigated the role of putative post-translational regulators in the control of type 3 secretion (T3S). We identified three proteins potentially implicated in the control of T3S: the chaperones HpaB, HpaD and the LRR protein HpaG. A shotgun secretome analysis with label-free quantification using tandem mass spectrometry was performed on the GMI1000 strain. 228 proteins were identified, among which a large proportion of T3Es. A focused secretome analysis using the three hpa mutants revealed a fine secretion regulation and specific subsets of T3Es with different secretion patterns. We showed that a set of T3Es are secreted in an Hpa-independent manner, whereas others show a positive or a negative Hpa-regulation of their secretion. In parallel, to better understand how these Hpa-proteins control the regulation of the secretion, we looked for Hpa-T3E direct interactions. We screened for HpaB and HpaD interactions with 38 R. solanacearum T3Es and we highlighted a set of shared and specific T3Es. In addition, to evaluate the impact of altered T3E secretion on plant pathogenesis, the hpa mutants were assayed on several host plants and different host specificities could be observed. In parallel, we have demonstrated that HpaP, a putative type 3 secretion substrate specificity switch (T3S4) protein of R. solanacearum controls T3E secretion. Interestingly, HpaP is required for full pathogenicity on several host plants (tomato, Arabidopsis thaliana, …). To better understand the role of HpaP on R. solanacearum pathogenicity, we analyzed the secretomes of the GMI1000 wild type strain as well as the hpaP mutant using mass spectrometry experiment (LC-MS/MS). The secretomes of both strains appeared to be quite similar and highlighted the modulation of the secretion of few type 3 substrates. Interestingly, only one T3 associated protein, HrpJ (putative component of the type 3 apparatus) was identified specifically secreted by the hpaP mutant. We showed that this protein was also specifically translocated by the mutant, and confocal microscopy experiments demonstrated an in planta cytoplasmic localization. The natural diversity of A. thaliana was also explored in response to the hrpJ delivery. Interestingly HrpJ is able to trigger necrosis in some accessions of a local population of A. thaliana. This necrosis responses seem to be associated with a plant acyl-transferase. All these data providing a better view of type 3 secretion control in R. solanacearum.