Caractérisation cellulaire de nouveaux traitements anti-VIH-1 ciblant la NucléoCapside et observation d’une forme compacte de Gag in cellulo

Cell caracterisation of new anti-HIV-1 treatment targeting NucleoCapsid and in cellulo observation of Gag compact form

• Auteur / Autrice : Manuel Pires
• Direction : Yves Mély, Hugues de Rocquigny
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie : aspects moléculaires et médicaux
• Date : Soutenance le 17/03/2017
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Serge Bouaziz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Serena Bernacchi, Olivier Delelis
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Serge Bouaziz, Andrea Cimarelli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines nucléocapside

Nucléosides antiviraux

Intégrase du VIH

Protéines virales

Aspect moléculaire

VIH (virus)

Mots clés libres

VIH-1

NCp7

Inhibiteurs

Gag

Forme compacte

Split-GFP

HIV-1

NCp7

Inhibitors

Gag

Compact shape

Split-GFP

Résumé

Les thérapies actuelles ciblant les étapes clés du cycle de réplication du VIH-1 sont puissantes et sélectives, mais des échecs thérapeutiques sont apparus en raison de l'émergence de résistance aux médicaments. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer de nouveaux médicaments qui utilisent des stratégies thérapeutiques alternatives. Cibler la protéine de nucléocapside (NCp7) est une stratégie prometteuse car NCp7 joue un rôle clé dans la réplication du VIH et sa séquence est hautement conservée dans les différentes souches du VIH. L’objectif du consortium européen THINPAD est de sélectionner des inhibiteurs spécifiques de la NCp7. Pour cribler les molécules, nous avons établi un test d’infectivité in cellulo utilisant la capacité des molécules sélectionnées à inhiber l'infection de cellules HeLa par des pseudo-particules non-réplicatives mimant la phase précoce du cycle d'infection virale du VIH-1. Afin de comprendre le mécanisme d'action des meilleures molécules sélectionnées, nous avons mis en place un test d'addition des molécules à différents temps post-infection et un test d'assemblage basé sur la technique de FRET-FLIM. La polyprotéine Gag est un précurseur nécessaire et suffisant pour la formation de particules virales mais le mécanisme de sélection de seulement deux copies d’ARN spécifique par virion est encore mal compris. Dans Gag, il y a deux sites d’interaction pour l'ARN. L’un de ces sites est le domaine de nucléocapside (NC), qui contient deux doigts de zinc capables de recruter l’ARN génomique viral. Le second site est constitué par les résidus basiques du domaine Matrice (MA). Ces deux sites peuvent interagir avec l'ARN simultanément et stabiliser la forme compacte de Gag. Pour démontrer in cellulo ce repliement de Gag, nous avons utilisé un système de split-Green Fluorescent Protein (GFP) et combiné différentes techniques de microscopie et de biochimie. Afin de compléter cette étude, le repliement sous forme compacte de différents mutants de Gag qui ont perdu totalement ou partiellement leurs capacités d’interaction avec l'ARN a également été étudié.

Current therapies targeting key steps of the HIV replication cycle are potent and selective, but clinical failures appeared due to the emergence of drug resistance. Hence, there is an urgent need for novel drugs and alternative therapeutic strategies. Targeting the HIV NucleoCapsid protein (NCp7) is a promising strategy since NCp7 plays key roles in HIV replication and its sequence is highly conserved across HIV strains. The European consortium THINPAD aims at selecting specific NCp7 inhibitors. To screen molecules, we established an in-cellulo infectivity-assay based on the ability of the selected hits to inhibit the infection of HeLa cells by non-replicative HIV-1 pseudoparticles mimicking the early phase of the virus infection cycle. In order to decipher the mechanisms of action of the best hits, we implemented a time of addition assay and a FRET-FLIM based assembly assay. The HIV-1 Gag polyprotein precursor is necessary and sufficient for the formation and the release of virus-like-particles but the mechanism of selection of only two copies of specific RNA per virion need to be further understood. In Gag, there are two interaction sites for RNA, namely the NucleoCapsid (NC) domain, which contains two zinc fingers able to recruit the dimeric virus genome, and the basic residues of the Matrix domain (MA). It was previously shown in vitro that these two sites can interact with RNA in order to stabilize a compact form of Gag. To demonstrate in cellulo this compact form of Gag, we used a split-Green Fluorescent Protein (GFP) system together with different microscopy and biochemical techniques. To complete this study, we monitored the folding of Gag mutants which have lost their ability to interact with RNA.