Régulation de la dynamique des microtubules par la kinase de stress JNK dans les cellules épithéliales : caractérisation de CLIP-170 comme un nouveau substrat.

Microtubule dynamics regulation by the stress kinase JNK in epithelial cells : characterization of CLIP-170 as a new substrate.

• Auteur / Autrice : Hélène Henrie
• Direction : Christian Poüs
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 15/12/2017
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathogenèse et traitement des maladies du foie (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Étienne-Manneville
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christian Poüs, Sandrine Étienne-Manneville, Anne Fourest-Lieuvin, Sylvia Soares, Franck Perez, Béatrice Benoit
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Fourest-Lieuvin, Sylvia Soares

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphorylation

Microtubules

MAP kinase

Mots clés libres

Microtubules

JNK (c-Jun NH2-Terminal Kinase)

CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa)

Beta-Tubuline

Sauvetage microtubulaire

Cellules épithéliales

Microtubules

JNK (c-Jun NH2-Terminal Kinase)

CLIP-170 (Cytoplasmic Linker Protein of 170 kDa)

Beta-Tubulin

Microtubule rescue

Epithelial cells

Résumé

Les microtubules sont des éléments dynamiques du cytosquelette qui contrôlent à la fois l’organisation du cytoplasme, la polarité, la migration et la division cellulaire. Notre laboratoire a précédemment montré que la kinase de stress JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) régule la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifères, en augmentant les vitesses de polymérisation, ainsi que les fréquences de sauvetage (transition vers une phase de repolymérisation). Alors que certaines protéines neuronales capables de réguler la dynamique des microtubules ont été identifiées comme des substrats de JNK, leurs équivalents dans les cellules épithéliales sont largement méconnus. Dans le but de comprendre comment JNK module la dynamique des microtubules dans les cellules épithéliales de mammifère, nous avons étudié deux substrats potentiels de JNK : la -tubuline et le facteur de sauvetage CLIP-170. Nous avons bien mis en évidence in vitro, une phosphorylation de la -tubuline par JNK sur une thréonine non-consensus, mais cette phosphorylation n’a pas été retrouvée dans les cellules HeLa, suggérant que la -tubuline n’est pas un substrat naturel de JNK in vivo. Nous avons mis en évidence par ailleurs que CLIP-170 est un nouveau substrat de JNK. Dans les cellules épithéliales, JNK activée phosphoryle trois résidus (Thr25, Thr45 et Ser147) situés dans la partie N-terminale de CLIP-170 de part et d’autre du premier domaine CAP-Gly qui est nécessaire pour l’interaction avec les microtubules. Ces acides aminés présentent des différences aussi bien dans leur phosphorylation basale que dans leurs cinétiques de phosphorylation par JNK sous divers stress. De plus, nous avons trouvé que dans différentes cellules épithéliales, la phosphorylation de ces sites est conservée. In vitro, ces résidus sont directement phosphorylés par JNK, préférentiellement quand le domaine N-terminal de CLIP-170 lie la tubuline. De plus, l’expression de mutants de CLIP-170 phospho-mimétiques et non-phosphorylables a montré que la phosphorylation de chaque site augmente la fréquence des sauvetages microtubulaires. Cette modulation n’est pas corrélée à une augmentation de la capacité de CLIP-170 à former des comètes aux extrémités plus en croissance ou à être retenue aux croissements microtubulaires, qui sont des sites de sauvetage potentiels.Ce travail a permis de décrire les premières phosphorylations de CLIP-170 qui stimulent sa fonction de sauvetage in vivo. Il souligne par ailleurs la complexité des mécanismes de sauvetage, qui demeurent un aspect encore énigmatique de l’instabilité dynamique des microtubules. L’activité de JNK sur CLIP-170 ne permet d’expliquer qu’une partie des effets de la kinase sur la dynamique des microtubules, aussi la recherche d’autres protéines cibles de JNK pouvant réguler notamment leur vitesse de polymérisation, reste à entreprendre.

Microtubules are dynamic cytoskeleton elements, which control cytoplasm organization, cell polarity, migration and division. Our laboratory has previously shown that the stress kinase JNK (c-Jun NH2-terminal Kinase) regulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, by increasing their growth rates, and their rescue frequencies (transition towards phases of repolymerization). While several neuronal proteins regulating microtubule dynamics have been identified as JNK substrates, their counterparts in epithelial cells are largely unknown. With the aim to understand how JNK modulates microtubule dynamics in mammalian epithelial cells, we studied two putative substrates of JNK: -tubulin and the rescue factor CLIP-170. Regarding -tubulin, using an in vitro kinase assay, we found that a non-consensus threonine is actually phosphorylated by JNK, but we were not able to find this phosphorylation in HeLa cells, suggesting that -tubulin is not a natural JNK substrate. In parallel, we found that CLIP-170 is a new substrate of JNK in epithelial cells. Activated JNK phosphorylates three residues (Thr25, Thr45 and Ser147) located in the N-terminal part of CLIP-170, on each side of the first CAP-Gly domain, which is required for CLIP-170 interaction with microtubules. These residues exhibit differences in their level of basal phosphorylation and their kinetics of phosphorylation by JNK under various stresses. Moreover, we found that in different epithelial cells, the phosphorylation of these sites is conserved. Using an in vitro kinase assay, we found that all these residues are directly phosphorylated by JNK, preferentially when the N-terminal domain of CLIP-170 binds tubulin. Furthermore, using phospho-mimetic and non-phosphorylatable CLIP-170 mutants in epithelial cells, we revealed that the phosphorylation of each site increases microtubule rescues. Such modulation operates without increasing CLIP-170 capability to form comets at the microtubule growing plus ends or to accumulate at microtubule crossings, which are potential rescue sites.This work described the first phosphorylations that enhance CLIP-170 rescue factor function in vivo. It also points out to which extent rescue mechanisms are complex and remain an elusive aspect of dynamic instability. JNK-mediated phosphorylation of CLIP-170 only partly explains the kinase effects on microtubule dynamics. Therefore, identifying other JNK targets that may regulate microtubule polymerization rate, remains to be addressed.