Structure et fonction des toxines bactériennes à domaine FIC

Structural and Biochemical studies of bacterial FIC toxins

• Auteur / Autrice : Simon Veyron
• Direction : Jacqueline Cherfils
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 11/12/2017
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie et pharmacologie appliquée (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2002-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Herman Van Tilbeurgh
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jacqueline Cherfils, Herman Van Tilbeurgh, Pedro Alzari, Jean-Michel Jault, Yves Mechulam, Isabelle Broutin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pedro Alzari, Jean-Michel Jault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cristallographie aux rayons X

Protéines bactériennes

Toxines bactériennes

Mots clés libres

Structure

Toxine

Fonction

Structure

Pathogen

Protein

Résumé

Les protéines à domaine FIC (Filamentation induced by cAMP) sont très répandues chez les bactéries où elles catalysent l’ajout d’une modification post-traductionnelle contenant un phosphate à une protéine cible, en utilisant différents co-substrats comme l’ATP. Certaines de ces protéines sont des toxines sécrétées par des pathogènes humains, mais la fonction de la plupart d’entre elles reste mystérieuse. Plus d’une dizaine de structures de protéines FIC ont été déterminées récemment, qui ont permis d’élucider leur mécanisme catalytique. L’une des sous-familles de protéines FIC possède un glutamate dans leur site catalytique, dont il a été proposé qu’il aurait une fonction auto-inhibitrice pour la fixation de l’ATP. Durant ma thèse, j’ai étudié la structure et les mécanismes de régulation de deux familles de protéines FIC : les protéines FIC à glutamate inhibiteur, et la toxine AnkX de la bactérie pathogène Legionella pneumophila.La première étude s’est intéressée à la protéine FIC de la bactérie pathogène Enterococcus faecalis (EfFIC), qui fait partie de la sous-famille des protéines FIC possédant un glutamate inhibiteur. J’ai résolu plusieurs structures cristallographique d’EfFIC, qui ont permis de caractériser son site catalytique et comment elle fixe l’AMP et l’ADP. En utilisant une propriété fréquemment observée d’auto-AMPylation (modification par l’AMP), j’ai montré au moyen d’ATP radioactif qu’EfFIC possède une activité basale d’auto-AMPylation, et j’ai identifié une nouvelle activité de dé-AMPylation. En m’inspirant des métaux observés dans mes structures cristallographiques, j’ai montré que l’alternance entre les activités d’AMPylation et de de-AMPylation dépend de la nature du métal fixé dans le site actif et de la présence du glutamate. Ce glutamate régulateur est également présent chez une protéine humaine, HYPE, qui possède une double activité d’AMPylation et dé-AMPylation d’ une chaperone du réticulum endoplasmique. Par un test de fluorescence, j’ai enfin montré que l’activité de HYPE était elle aussi régulée par les métaux comme celle de EfFIC. Ces résultats suggèrent un nouveau modèle de régulation partagé par des protéines FIC de la bactérie à l’homme.La seconde étude a porté sur la toxine AnkX de Legionella pneumophila, qui modifie les petites protéines G de la famille de Rab Rab1 et Rab35 (régulatrices du trafic cellulaire) par une molécule de phosphocholine (PC). En utilisant des liposomes de composition contrôlée, j’ai montré qu’AnkX interagit avec les membranes, et j’ai identifié par mutagenèse son domaine d’interaction avec les membranes. Au moyen de petites GTPases Rab ancrées artificiellement à la surface de liposomes par une queue 6his remplaçant le lipide naturel, j’ai montré que l’activité d’AnkX est stimulée par la présence de membranes. Des résultats préliminaires suggérent que Rab35 est un meilleur substrat que Rab1a, ce qui pourrait renseigner sur la fonction et le compartiment cellulaire où se trouve la toxine. J’ai ensuite mené une étude structurale d’AnkX par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), qui permet d’obtenir des informations structurales en solution. AnkX est constitué d’un domaine FIC, de répétitions ankyrine et d’un domaine C-terminal. L’analyse en SAXS montre que ces domaines s’organisent en forme de fer à cheval, suggérant un modèle d’association bi-partite du complexe AnkX/Rab aux membranes. L’ensemble de ces résultats conduit à un modèle dans lequel l’activité d’AnkX est régulée spatialement par les membranes, ce qui pourrait lui permettre de cibler à la fois les petites GTPases Rab cellulaires et le compartiment membranaire.

FIC (Filamentation induced by cAMP ) domain containing proteins are widespread in bacteria where they use different substrate such ATP to modify a target protein with a phosphate containing post-translational modification. Some of those proteins are secreted toxins from pathogens but the function of the majority stay unknown. Some recently resolved structures explain the catalytic mechanism. A subfamily of FIC proteins was proposed to be auto-inhibited for ATP binding by a glutamate in their active site. In my thesis, I lead a structural and biochemical study of two FIC proteins family: the auto-inhibited by a glutamate FIC proteins and the Legionella pneumophila toxin AnkX.For the first study, I focused on the pathogenic bacteria Enterococcus faecalis protein EfFIC that is an auto-inhibited FIC protein. I solved several crystallographic structures to characterize the active site and the AMP and ADP binding. Using the classic auto-AMPylation (modification with an AMP molecule) mechanism and radioactive ATP, I showed that EfFIC is active and I identified a new de-AMPylation activity. Using metals found in my crystallographic structures, I showed that the AMPylation and de-AMPylation switch is controlled by the nature of the metal bound in the active site and that this switch is inhibitory glutamate-dependent. This glutamate is found in human HYPE that shows a double AMPyaltion and de-AMPylation activity of the ER chaperone BIP. Using fluorescence assays, I showed that those two activities are alors regulated by metals as in EfFIC. Those results point on a new regulation model shared between FIC proteins from bacteria to human.The second study focused on Legionella pneumophila toxin AnkX that modifies small GTPases Rab1 and Rab35 with a phosphocholine (PC) molecule. Using controlled composition liposomes, I showed that AnkX interact with membranes and mapped the interaction domain by mutagenesis. With artificially anchored to nickel containing liposomes surface Rab GTPases, I demonstrated the stimulation of AnkX activity by the membranes. Preliminary results also suggest that Rab35 is a better substrate than Rab1a, giving information on AnkX function and localization during infection. I lead a small angle X-ray scattering (SAXS) study on AnkX that gave low-resolution structural information on AnkX in solution. The analyses of SAXS results show that AnkX is horseshoe shaped, suggesting an association with the membrane and Rab of AnkX model. In this model, membranes spatially regulate AnkX, allowing a targeting of Rab and cellular compartment targeting.