Identification et caractérisation fonctionnelle de gènes contrôlant la fréquence de crossovers méiotiques.

Identification and Functional Characterization of Genes Involved in the Control of Meiotic Crossover Frequency.

• Auteur / Autrice : Joiselle Blanche Fernandes
• Direction : Raphaël Mercier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 21/09/2017
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences du végétal : du gène à l'écosystème (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jean-Pierre Bourgin (Versailles ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Jacqui Shykoff
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Raphaël Mercier, Jacqui Shykoff, Bernard de Massy, Ian Henderson, Valérie Borde, Bertrand Llorente
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bernard de Massy, Ian Henderson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Recombinaison génétique

Enjambement (génétique)

Méiose

Mots clés libres

Meiose

Crossover

Recombination

Meiosis

Crossover

Recombination

Résumé

Les crossing-overs (CO) sont issus d’échange réciproque de matériel génétique entre les chromosomes homologues. Les COs produisent de la diversité génétique et sont essentiels chez la plupart des eucaryotes, pour la distribution équilibrée des chromosomes lors de la méiose. Malgré leur importance, et un large excès de précurseurs moléculaires, le nombre de CO est très limité dans la grande majorité des espèces (Typiquement 1 à 4 par paire de chromosomes). Cela suggère que les COs sont étroitement régulés, mais les mécanismes sous-jacents sont mal connus. Pour identifier les gènes qui limitent la formation des CO, l’équipe a mené un crible génétique chez Arabidopsis thaliana. Ces travaux ont mené à l’identification de plusieurs facteurs anti-CO, définissant trois voies : (i) L’hélicase FANCM et ses co-facteurs ; (ii) L’AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE-1 (FIGL1) ; (iii) Le complexe RECQ4-Topoisomerase 3α-RMI1.Le premier objectif de ma thèse est d’explorer les relations entre ces trois voies en s’attachant aux questions suivantes ; (1) Jusqu’où peut-on augmenter la recombinaison en combinant les mutations dans FANCM, FIGL1 et RECQ4 ? Nous avons montré que la plus forte augmentation de recombinaison était obtenue dans recq4 figl1, atteignant 7,5 fois la fréquence du sauvage en moyenne sur le génome. (2) Quel est la distribution de ces extra-COs ? L’augmentation de recombinaison n’est pas homogène le long du génome : Les fréquences de CO augmente fortement des centromères vers les télomères, avec les plus hautes fréquences observées dans les régions distales. (3) La modification des fréquences de recombinaison est-elle identique lors des méioses mâles et femelle ? Chez le sauvage, la fréquence de recombinaison est plus élevée lors de la méiose mâle que femelle. Au contraire, la recombinaison femelle devient plus élevée que la recombinaison mâle chez les mutants recq4 et recq4 figl1. Ceci suggère que des contraintes qui s’appliquent sur la formation des CO lors de la méiose femelle sont relâchées chez ces mutants. En poursuivant le crible génétique, un nouveau mutant hyper-recombinant a été identifié. Le second objectif de ma thèse fut d’identifier et de caractériser fonctionnellement le gène correspondant. Une cartographie génétique et des études d’interactions protéine-protéine, ont mené à l’identification d’un facteur qui interagit directement avec FIGL1 et semble former un complexe conservé depuis les plantes jusqu’au mammifères. Nous avons baptisé cette protéine FLIP (Fidgetin-like-1 interacting protein). Les fréquences de recombinaisons sont augmentées dans flip-1, confirmant que FLIP1 limite la formation des COs. Des études d’épistasie ont montré que FLIP et FIGL1 agissent dans la même voie. De plus les protéines FIGL1/FLIP d’Arabidopsis ou humaine, interagissent avec RAD51 et DMC1, les deux protéines qui catalyse une étape clef de la recombinaison, l’invasion d’un ADN homologue. Finalement, dans flip comme dans figl1, la dynamique de DMC1 est modifiée. Nous proposons donc un modèle dans lequel le complexe FLIP-FIGL1 régule négativement l’activité de RAD51/DMC1 pour limiter la formation des COs. L’étude du complexe conservé FLIP-FIGL1 a mis en évidence un nouveau mode de régulation de la recombinaison, qui agit vraisemblablement à l’étape clé de l’échange de brin homologue. De plus, l’augmentation des CO sans précédent obtenues chez recq4 figl1 peut être d’un grand intérêt pour l’amélioration des plantes en permettant de diversité de nouvelles combinaisons alléliques.

Meiotic crossovers (CO) are formed by reciprocal exchange of genetic material between the homologous chromosomes. CO generate genetic diversity and are essential for the proper segregation of chromosomes during meiosis in most eukaryotes. Despite their significance and a large excess of CO precursors, CO number is very low in vast majority of species (typically one to three per chromosome pair). This indicates that COs are tightly regulated but the underlying mechanisms of this limit remain elusive. In order to identify genes that limit COs, a genetic screen was performed in Arabidopsis thaliana. This led to the identification and characterization of several anti-CO factors belonging to three different pathways: (i) The FANCM helicase and its cofactors (ii) The AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE-1 (FIGL1) (iii) The RECQ4 -Topoisomerase 3α-RMI1 complex. The first objective was to understand the functional relationship between these three pathways and to address following questions: (1) how far can we increase recombination when combining mutations in FANCM, FIGL1 and RECQ4? We show that the highest increase in recombination was obtained in figl1 recq4, reaching to 7.5 fold the wild type level, on average genome wide. (2) How is the distribution of recombination events genome wide in mutants? The increased CO frequency in the mutants was not uniform throughout the genome. CO frequency rises from the centromere to telomeres, with distal intervals having highest COs (3) is the recombination frequency increase same in both male and female? In Arabidopsis wild type, male has higher recombination than female meiosis. In contrast, in recq4 and recq4 figl1, female recombination was higher than male. This suggests that certain constraints that apply to CO formation in wild type females are relieved in the mutant. By continuing the same genetic screen, a novel anti-CO mutant was identified. The second objective was to identify and functionally characterize the corresponding gene. Genetic mapping and protein interaction studies led to the identification of a factor that directly interacts with FIGL1 and appears to form a conserved complex both in Arabidopsis and humans. Hence, the factor was named FLIP (Fidgetin-like-1 interacting protein). Recombination frequency is increased in flip, confirming that FLIP limit COs. Epistasis studies showed that FLIP and FIGL1 act in same pathway. Further, FIGL1/FLIP proteins of Arabidopsis and humans directly interact with the recombinases RAD51 and DMC1 which catalyze a crucial step of homologous recombination, the inter homolog strand invasion. In addition flip like figl1 modifies dynamics of DMC1. We thus propose a model wherein the FLIP-FIGL1 complex negatively regulates RAD51/DMC1 to limit CO formation. Studying the conserved FIGL1-FLIP complex led to the identification of a novel mode of regulation of recombination, that likely acts at the key step of homologous strand invasion. Further the unprecedented level of CO increase in recq4figl1 in hybrids could be of great interest for crop improvement, allowing the production of novel allele combinations.