Étude quantitative du rôle spécifique de glycosaminoglycanes dans le mécanisme d'internalisation de l'homéoprotéine engrailed 2

Quantitative study of glycosaminoglycan specific role on internalization mecanism of the homeoprotein engrailed 2

• Auteur / Autrice : Sébastien Cardon
• Direction : Sandrine Sagan, Ludovic Carlier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie moléculaire
• Date : Soutenance le 12/10/2017
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie moléculaire de Paris Centre (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)
• Jury : Président / Présidente : Chahrazade El Amri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Sagan, Ludovic Carlier, Chahrazade El Amri, Céline Landon, Romain Vivès, Michel Desmadril
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Céline Landon, Romain Vivès

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimie

Mots clés libres

Homéoprotéine Engrailed 2

Interaction protéine-Polysaccharides

Héparanes sulfate et chondroïtines sulfates

Relation structure-Activité

ITC

RMN

Engrailed 2 homeoprotein

Protein-Polysaccharides interaction

Sulfate heparan and sulfate chondroitin

Structure-Activity relationship

ITC

NMR

Résumé

Les homéoprotéines sont des facteurs de transcription importants au cours du développement des organismes vivants, capables notamment de voyager de cellule en cellule. Ces protéines comportent une longue extrémité N-terminale désordonnée, suivie de trois hélices α séparées par une boucle et un tour. Des études de relations structure-activité ont montré que des domaines cationiques (riches en K et R) particuliers dans ces protéines sont responsables de ces propriétés de transfert cellulaire leur permettant d’être secrétées et internalisées dans les cellules. Ces processus impliquent que ces protéines hydrophiles soient capables de franchir la membrane plasmique composée d'un coeur hydrophobe. La membrane plasmique est en effet composée d’une bicouche lipidique, dans laquelle sont insérées de nombreuses protéines, telles que les protéoglycanes portant des ramifications de glycosaminoglycanes (GAG), polysaccharides anioniques. Dans le but de comprendre au niveau moléculaire le processus d'entrée des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes, différentes constructions protéiques ont été produites et étudiées : le peptide pénétrant les cellules correspondant à l'hélice 3 (H3), la séquence correspondant à l'homéodomaine (HD), l'homéodomaine étendu d'une séquence putative de liaison aux GAG (NLS-HD) et la protéine entière (En2). La quantification absolue de l’entrée de ces constructions dans des cellules CHO-K1 par spectrométrie de masse a mis en évidence une efficacité d'entrée meilleure pour H3 > NLS-HD > HD, ainsi que l’importance des GAG de surface dans le processus et plus particulièrement celui des héparanes sulfates (HS). Des expériences complémentaires d’ITC, de dichroïsme circulaire et de RMN ont permis d'identifier deux sites d’interaction avec l’héparine (un site principal de haute affinité et un site secondaire de plus basse affinité), interagissant principalement avec le polysaccharide par interactions électrostatiques. In fine, ces études conduisent à une meilleure compréhension moléculaire du processus d'internalisation des homéoprotéines dans des cellules eucaryotes.

Homeoproteins are important transcription factors during the development of living organisms, and are able to travel from cell to cell. These proteins contain a long N-terminal extremity structurally disordered, followed by three α helices separated by a U-turn. Structure-activity relation studies have shown that in these proteins, some cationic domains (rich in K and R) confer them the cellular transfer properties, allowing them to be secreted by and internalized into cells. These processes imply that the hydrophilic proteins are able to cross plasma membrane. Indeed, the plasma membrane possess a hydrophobic heart and is composed by a lipidic bilayer, in which numerous proteins are inserted, such as proteoglycans carrying glycosaminoglycan (GAG) ramifications, that belong to anionic polysaccharids. In order to understand the entry process of homeoproteins into eukaryotic cells at a molecular level, different proteic constructions have been produced and studied: the cell penetrating peptide corresponding to the third α helix (H3), the sequence corresponding to its homeodomain (HD), the homeodomain with an added putative GAG-binding domain (NLS-HD), and the wild-type protein Engrailed 2 (En2). The absolute mass spectrometry quantification of the peptide and proteins in cells shows a range of internalization efficiency as follows: H3 > NLS - HD > HD. It also highlights the importance of cell-surface GAGs in the internalization and more particularly that of heparan sulfates (HS). Complementary experiments of ITC, circular dichroism and NMR have shown two interaction sites for the heparin (one principal site of high affinity and a secondary site showing a lower affinity) both interacting mainly with polysaccharidic residues using electrostatic interactions. In fine, these studies lead to a better molecular understanding of homeoproteins internalization process in eukaryotic cells.