Thèse soutenue

Développement d’une méthode de purification non-chromatographique de peptides riches en cystéine par immobilisation temporaire

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Auteur / Autrice : Alba Casas Mora
Direction : Agnès F. DelmasVincent Aucagne
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie
Date : Soutenance le 12/12/2017
Etablissement(s) : Orléans
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....)
Jury : Président / Présidente : Josef Hamacek
Examinateurs / Examinatrices : Agnès F. Delmas, Vincent Aucagne, Josef Hamacek, Laurent Devel, Sophie Faure, Pascal Kessler
Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Devel, Sophie Faure

Résumé

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Bien que la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) soit maintenant une technique mature et très largement popularisée pour des peptides simples, certaines séquences restent encore compliquées à produire, comme les peptides riches en ponts disulfure (DRPs). Ces produits naturels, ligands sélectifs d’un grand nombre de cibles thérapeutiques, sont des outils pharmacologiques de premier ordre et sont considérés comme de bons candidats médicaments. La proportion importante de cystéines dans leur séquence (plus de 10%) leur confère des propriétés remarquables, mais limite aussi leur synthèse,conduisant à des purifications HPLC délicates, associées à des rendements faibles et une pureté médiocre.Dans l’optique de simplifier la production de DRPs par voie chimique, notre but est de proposer une méthode de purification non-chromatographique. Pour cela, nous avons développé un bras N-terminal conçu pour être complètement compatible avec les peptides riches en cystéines: Boc-Cys(Trt)-1-{6-[1,3-diméthyl-2,4,6(1H,3H,5H)trioxopyrimidine-5-ylidène]hexyle}. A la fin de l’élongation sur support solide, ce bras est introduit sélectivement à l'extrémité N-terminale du peptide cible, sans réagir avec les peptides tronqués acétylés qui constituent les principales impuretés de la SPPS. Après coupure de la résine SPPS, le peptide cible est immobilisé sur un second support solide par le biais d’une réaction de ligation chimique native(NCL). Les peptides tronqués sont alors éliminés par simple filtration, puis le peptide cible est relargué en solution par coupure du bras N-terminal. Ayant comme objectif d’élargir par la suite notre stratégie à la synthèse de très longs DRPs via l’assemblage de multiples segments peptidiques par NCLs successives enphase solide, nous avons étudié en détail la stabilité et les conditions de coupure du bras.La méthode a été appliquée à la purification de deux séquences naturelles riches en cystéines et biologiquement pertinentes : AvBD2 (36 AA), un peptide antimicrobien appartenant à la famille des β défensines aviaires et Bv8 (77 AA) un peptide d’amphibien de la famille des prokinéticines.