Caractérisation et compréhension du mécanisme des nanovecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules biologiques

Characterization and understanding of mechanism of nanovectors for the intracellular delivery of biological macromolecules

• Auteur / Autrice : Laurence Dallet
• Direction : Bruno Pitard, Olivier Lambert
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biomolécules, pharmacologie, thérapeutique
• Date : Soutenance le 19/05/2017
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé Nantes-Angers
• Partenaire(s) de recherche : COMUE : Université Bretagne Loire (2016-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Intégrée Nantes Angers
• Jury : Président / Présidente : Philippe Barthélémy
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Patrick Moreau, Marie-Pierre Rols

Mots clés

Mots clés contrôlés

Kératine-8

Lutte contre

Maladies

Thérapie génique

Mots clés libres

Cryo-MET

Résumé

L’un des challenges dans la délivrance intracellulaire de macromolécules biologiques est le développement de vecteurs adaptés et efficaces. Des études précédentes ont identifiés les dérivés lipidiques d’aminoglycosides comme étant d’excellents candidats pour la délivrance d’acides nucléiques et récemment de protéines. La délivrance intracellulaire de protéines thérapeutiques représente une approche originale pour le traitement de pathologies car elles ont la capacité d’agir sur des voies de signalisation intracellulaire. Dans cette étude, nous avons identifié les relations entre les caractéristiques physico-chimiques des vecteurs et leur capacité à délivrer efficacement les molécules biologiques au sein des cellules. Pour y parvenir nous avons mis en oeuvre une stratégie originale en étudiant les corrélations existantes par microscopie de fluorescence et électronique. Nous avons ainsi identifié un système micellaire à base d’aminoglycoside permettant la délivrance d’une protéine thérapeutique (anticorps K8-FITC) au sein de cellules vivantes. Les complexes lipide/anticorps sont internalisés par la voie macropinocytose et cavéoledépendant (CvME) dont cette dernière est majoritaire. Ensuite, les complexes concentriques et multilamellaires (25 nm et 1 μm de diamètre) se retrouvent dans des vésicules intracellulaires et sont libérés par un mécanisme de « flipflop ». La formation du couple lipides anioniques/cationiques permet le détachement de l’anticorps et sa libération dans le cytoplasme. Par microscopie corrélative et tomographie, il a été démontré que l’anticorps se distribuait dans l’ensemble de la cellule et restait fonctionnel, attesté par la fixation sur des filaments intermédiaires de cytokératine 8.

One of the challenges in the intracellular delivery of biological macromolecules is the development of suitable and efficient vectors. Previous studies have identified lipid derivatives of aminoglycosides as excellent candidates to the delivery of nucleic acids and recently proteins. The intracellular delivery of therapeutic proteins represents an original approach for the treatment of pathologies because they have the capacity to act on intracellular signaling pathways. In this study, we identified the relationships between physico-chemical characteristics of vectors and their ability to efficiently deliver biological molecules within cells. To achieve this, we have implemented an original strategy by studying the existing correlations by fluorescence and electron microscopy. We have thus identified an aminoglycoside-based micellar system allowing the delivery of a therapeutic protein (K8- FITC antibody) within living cells. The lipid/antibody complexes are internalized by the macropinocytosis and caveolae-dependent pathway (CvME), of which the latter is the majority. Then, the concentric and multilamellar complexes (25 nm and 1 μm in diameter) are found in intracellular vesicles and are released by a ''flip-flop'' mechanism. The formation of the anionic/cationic lipid couple allows detachment of the antibody and its release into the cytoplasm. By correlative microscopy and tomography, it was demonstrated that the antibody was distributed throughout the cell and remained functional, ascertained by the fixation on intermediate filaments of cytokeratin 8.