Développement d'inhibiteurs allostériques de l'ecto-5'-nucléotidase (CD73) : application aux traitements anticancéreux

Structure-based drug design of allosteric ecto-5'-nucleotidase inhibitors : application to cancer treatment

• Auteur / Autrice : Rahila Rahimova
• Direction : Laurent Chaloin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 15/09/2017
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuel Cornillot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Chaloin, Isabelle André, Christine Ménétrier-Caux, Suzanne Peyrottes, Gennady Yegutkin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle André, Christine Ménétrier-Caux

Mots clés

Mots clés contrôlés

5'-Nucleotidase

Résistance aux médicaments

Anticancéreux

Mots clés libres

Nucléotidase cytosolique humaine

Humaine ecto-Nucléotidase

La conception de médicaments à base de fragments

Inhibiteurs allostériques

La résistance au traitement anti-Cancer

Human cytosolic nucleotidase II; cN-II

Human ecto-Nucleotidase; CD73

Sbdd

Allosteric inhibitors

Anti cancer treatment

Résumé

Le cancer représente l'un des problèmes majeurs en santé publique. Jusqu'à présent, en parallèle de l'intervention chirurgical, plusieurs traitements ont été mis au point et largement utilisés en thérapie clinique telles que les chimiothérapies. Cependant, leur efficacité est parfois limitée et couplée à des effets secondaires très néfastes, laissant les patients dans une impasse thérapeutique. Par conséquent, de nouvelles approches thérapeutiques doivent être développées sur de nouvelles cibles avérées en oncologie afin d'apporter des soins personnalisés aux patients. La première partie de mon travail de thèse a été dédiée à la compréhension des mécanismes moléculaires de la nucléotidase cytosolique de type II (cN-II), une enzyme du métabolisme des purines dont l'implication dans des phénomènes de résistance à des traitements anticancéreux a pu être démontrée. Aussi, une étude sur la cinétique enzymatique à l'état pré-stationnaire et stationnaire a été entreprise sur la forme sauvage et une forme mutée de l'enzyme lui conférant une activité accrue fortement impliquée dans les cas de résistance. Par cette approche, il a été possible de décortiquer le mécanisme cinétique, de définir l'étape cinétiquement limitant afin d'identifier les intermédiaires prépondérants de la réaction pouvant être ciblés pour le développement de nouveaux inhibiteurs. Cette étude cinétique est présentée dans ce premier volet de la thèse. En second lieu, mon travail s'est focalisée sur un second membre de cette famille d'enzyme qui est l'ecto-5'-nucléotidase (CD73). Cette enzyme exprimée sous forme dimérique à la surface extracellulaire régule la concentration en adénosine extracellulaire (par hydrolyse de l'adénosine monophosphate), ce dernier étant un puissant immunosuppresseur de la réponse immune anticancéreuse. L'objectif de mon travail de thèse a été de développer de nouveaux inhibiteurs de type allostérique en utilisant une approche basée sur la structure tridimensionnelle et la dynamique moléculaire. Une des étapes clés a été tout d'abord de mettre au point un système expression hétérologue afin d'obtenir l'enzyme recombinante en quantité suffisante pour les études enzymatiques ultérieures. Différents systèmes d'expression ont été testés et seul le système en cellules d'insecte infectées par le baculovirus a permis d'obtenir l'enzyme active en grande quantité. En parallèle, une étude in silico a permis de reproduire la dynamique fonctionnelle de l'enzyme requise pour sa fonction. A partir de ses données, un criblage virtuel d'une chimiothèque de 324 000 molécules a été réalisé sur le site de dimérisation et a permis d'identifier 33 composés chefs de files. Parmi, ces composés, dix molécules se sont avérés être de puissants inhibiteurs de CD73 (Ki < 1 µM) avec un mécanisme d'inhibition de type allostérique ou non-compétitif. La cytotoxicité des composés a été évaluée sur des lignées cellulaires transformées ou tumorales montrant un effet uniquement à des concentrations très élevées (supérieures à 100 µM). L'étude des relations structure-fonction devrait permettre à présent de proposer de voies d'optimisation afin d'améliorer l'efficacité des composés les plus actifs afin d'aboutir à de nouveaux candidats médicaments.

Cancer burden still remains a major worldwide health problem. To date, several types of conventional anticancer treatments are widely used in clinical. However, the alternative effects of these treatments often leave patients impaired. Therefore, it is required to understand the unique medical needs of individual patients and to conduct effective, high–quality research focusing on the not yet identified oncotargets.The first part of my thesis is dedicated to decipher molecular basis of cN-II reaction. This study characterizes the steady state and transient state kinetics of cN-II wild type and hyperactive mutant which involved in cancer treatment resistance. Furthermore, the characterization of the rate-limiting step and reaction intermediates gave insights into the binding mechanisms and the development of small molecules inhibitors of cN-II.In the second part of this work, we aimed to investigate allosteric inhibitors of CD73 using structure-based drug design approach. In this study the suitable protein expression system was established for the production of sufficient quantities of fully active CD73. This work followed by in silico studies, including molecular dynamics, virtual screening, and hits identification and in vitro hits validations and kinetics characterizations. The cytotoxicity of the most powerful inhibitors exhibited on different cell types was determined. SAR studies gave insights into the binding mode of best compounds and function.