Role of M1 protein and actin-associated cellular cofactors in Influenza A Virus assembly and release

par Shantoshini Dash

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Delphine Muriaux et de Etienne Decroly.

Le président du jury était Winfried Weissenhorn.

Le jury était composé de Delphine Muriaux, Etienne Decroly, Béatrice Riteau.

Les rapporteurs étaient Béatrice Riteau.

  • Titre traduit

    Rôle de la protéine M1 et des cofacteurs cellulaires associés à l’actine dans l’assemblage et la libération du virus de la Grippe A


  • Résumé

    Le virus de la grippe A (le H1N1) pdm09, généralement connu comme le virus de la grippe porcine, a causé la toute première pandémie du 21e siècle. Le virus de grippe est un virus enveloppé à ARN qui utilise la machinerie cellulaire de l’hôte pour s’assembler à la membrane plasmique de la cellule et être relargué à l’extérieur. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la protéine virale de matrice M1 dans ce processus. M1 est la protéine la plus abondante et elle est extrêmement importante pour le virus de la grippe. Les 164 résidus de la protéine M1 situés en N-terminal comprennent deux domaines basiques qui sont : le triplet d’arginine (R76/77/78) sur l'hélice 5 et le signal de localisation nucléaire sur l'hélice 6. Ils sont très bien conservés parmi les sous types de la grippe. Premièrement, pour étudier l'interaction M1-membrane, nous avons développé et standardisé un système minimal regroupant M1+M2+NS1/NEP (±M) dans lequel nous pourrons aussi observer la production de VLPs incorporant M1. En utilisant ce système, nous avons créé des mutations dans le triplet d’arginine de M1 et avons regardé l'accrochage de M1 à la membrane ainsi que l'incorporation de M1 dans les VLPs. La conséquence de ces mutations est que la protéine M1 reste dans le cytosol et qu’il y a une réduction drastique du nombre de VLPs contenant M1 relargués. La mutation du triplet arginine par un triplet alanine inhibe complètement la production de VLPs. De plus, un virus mutant avec ce triplet d’alanine n’est plus capable de produire des virions infectieux. Ainsi nous avons mis en évidence l'importance du triplet arginine dans l'accrochage de M1 à la membrane et la production de virions. Par conséquent, pour étudier l’utilisation de l'actine et de ses cofacteurs par le virus, nous avons utilisé de petits ARN interférents pour inhiber l’expression de gènes dans un système minimal de production de VLPs. Nous avons observé une réduction de la production de VLPs contenant M1 en inhibant Rac1et une augmentation de la libération de VLPs contenant M1 en inhibant RhoA et Cdc42. En utilisant un virus IAV (H3N2)-nanoluciferase sur les cellules A549 pulmonaires, nous avons étudié l'effet de la déplétion des RhoGTPases et de leurs effecteurs sur la production virale. Nous avons observé qu'avec Rac1, l'inhibition de Wave2 et Arp3 réduit aussi le pouvoir infectieux du virus H3N2 au cours des étapes tardives de l'infection sans affecter la phase précoce de d'infection. Les protéines interagissant avec M1 ont été identifiées par LC-MS/MS et incluent la cofiline et l’annexine A2. La cofiline, déjà connue pour participer à la réorganisation de l’actine pendant la phase tardive de l’infection par le virus de la grippe, est aussi un effecteur activé par Rac1, Wave2, Pak1 et LIMK afin de former des lamellipodes. L’annexine A2 est aussi connue pour séquestrer la PS au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique cellulaire. La reconnaissance de ces groupes de PS par la protéine virale M1 amorcera finalement le processus d’assemblage viral. Ainsi, nos résultats, en décrivant le mécanisme d'accrochage de M1 à la membrane, montrent aussi que Rac1, Wave2 et Arp3 sont probablement des facteurs pro-viraux de l’assemblage et de la libération des virus de la grippe A.


  • Résumé

    The influenza A(H1N1)pdm09 virus, commonly known as swine flu, caused the very first pandemic of 21st century. Influenza virus, an enveloped RNA virus, uses the host cellular machinery for its assembly and release from the host cell plasma membrane. In this study, we were interested in the role of the viral M1 matrix protein in this process. M1 is the most abundant and vitally important protein present in influenza virus. The N-terminal 164 residues of M1 protein comprise of two basic domains which are the arginine triplet (R76/77/78) on helix 5 and the nuclear localization signal on helix 6, which are very well conserved among the influenza A virus subtypes. Firstly, to study M1-membrane interaction, we developed and standardized a minimal system consisting of M1+M2+NS1/NEP(±M) in which we could also observe production of VLPs incorporating M1. Using this system, we performed mutations in the M1 arginine triplet and looked at changes in M1 membrane attachment and M1 incorporation in VLP. As a result of these mutations, the M1 protein remained cytosolic and there was a drastic reduction in M1 containing VLP release. Mutating the entire arginine triplet to an alanine triplet inhibited VLP production completely. Also, a mutant virus with this alanine triplet failed completely to produce infectious virions. Thus we established the importance of the arginine triplet in M1 membrane attachment and virion production. Consequently, to study manipulation of actin and its cofactors by the virus, we used siRNA mediated gene silencing in the VLP producing minimal system. We observed a reduction in M1 containing VLP production upon inhibition of Rac1 and enhancement of M1 containing VLPs released upon inhibition of RhoA and Cdc42. By using an IAV (H3N2)-nanoluciferase virus on pulmonary A549 cells, we studied effect of depletion of RhoGTPases and their effectors on virus production. We observed that along with Rac1, inhibition of Wave2 and Arp3 also reduces the infectivity of H3N2 virus at the late phase of infection without any effect on the early phase of infection. The proteins interacting with M1 were identified by LC-MS/MS and included cofilin and annexin A2. Cofilin, already known to take part in the actin reorganization during the late phase of influenza A virus infection, is also one of the downstream effector linked to Rac1, Wave2, Pak1 and LIMK, for lamellipodia formation. Annexin A2 is also known to sequester PS at the inner leaflet of the cell plasma membrane. The viral protein M1 is able to recognize these clusters of PS, which ultimately initiates the viral assembly process. Thus, our results, while defining the mechanism of M1 membrane attachment, also indicate the possible involvement of Rac1, Wave2 and Arp3 as pro-viral factors in IAV assembly and release.

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