Approches multiples d'ingénierie pour l'utilisation d'enzymes hydrolytiques comme outils de synthèse

Combinatorial strategies to engineer synthetic ability in hydrolytic enzymes

• Auteur / Autrice : Julien Durand
• Direction : Michael O'Donohue, Sophie Bozonnet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie Microbienne et Enzymatique
• Date : Soutenance le 01/12/2017
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés - Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés / LISBP
• Jury : Président / Présidente : Charles Tellier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michael O'Donohue, Sophie Bozonnet, Sylvie Armand, Regis Faure
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Guy Berrin, Uwe Bornscheuer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chimie verte

Mots clés libres

Chimie verte

Biocatalyseur enzymatique

Évolution dirigée

Synthèse de molécules

Green chemistry

Enzymatic biocatalyst

Directed evolution

Molecule synthesis

Résumé

La Chimie Verte s’engage entre autres à mettre au point des procédés plus respectueux de l’environnement et à émanciper de la pétrochimie les filières industrielles de fabrication de produits. Dans ce contexte, les enzymes représentent des alternatives de choix pour réaliser des réactions de synthèse de molécules écoresponsable à partir de la biomasse végétale. - L’endoglycocéramidase II de Rhodoccoccus sp. M-777, une glycoside-hydrolase, a été la cible d’un travail d'ingénierie du site actif afin de réorienter son activité hydrolytique vers la synthèse de polyglucosides d’alkyles, de potentiels biosurfactants. Une transglycosylase permettant d’atteindre des rendements de production de plus de 70% a été obtenue. La modélisation de la mutation permet de proposer des pistes sur les raisons de cette inversion du ratio hydrolyse/transglycosylation.- Une stratégie d'évolution dirigée a été appliquée à la féruloyle-estérase A d’Aspergillus niger pour la rendre plus résistante aux chocs thermiques et à la présence de solvants, deux propriétés requises pour utiliser cette enzyme pour des réactions de transfert dans des conditions thermodynamiquement favorables. Un catalogue d’enzymes améliorées, pour les deux propriétés, a été obtenu. L'accumulation de ces connaissances permettra de pouvoir plus efficacement rationaliser le design de biocatalyseur pour la synthèse de molécules, en accord avec les attentes de la chimie verte.

Green chemistry promotes the development of more environmentally friendly processes and the ending of polluting petrochemical industries by promoting the use of renewable resources. In this context, enzymes represent interesting alternatives catalysts for chemical transformations. Notably, they constitute tools of choice for synthesis of organic molecules from plant biomass.- Endoglycoceramidase II from Rhodococcus sp. M-777, a retaining glycoside hydrolase, was subjected to active-site remodelling in order to reorient its activity towards the synthesis of alkyl-polyglucosides, molecules with potential biosurfactant properties. Thus, an efficient transglycosylase able to reach production yield of more than 70% of alkyl-cellobiosides was obtained. A modelling study help to identify the determinants of this complete reversion of the transfer / hydrolysis ratio.- A directed evolution strategy was applied to Aspergillus niger feruloyl-esterase A, in order to make it more resistant to heat shocks and to the presence of solvents, two prerequisites to use this enzyme for transfer reactions under thermodynamically favourable conditions. This led to the establishment of a catalog of optimized enzymes for their thermostability, their solvent resistance, or both properties.These results will pave the way towards a more efficient way to rationally design biocatalysts meeting the expectations of green chemistry.