Etude des dynamiques de réponses physiologiques et métaboliques de Yarrowia lipolytica à des perturbations environnementales physico-chimiques

Study of the dynamics of physiological and metabolic responses of Yarrowia lipolytica to environmental physico-chemical perturbations

• Auteur / Autrice : Asma Timoumi
• Direction : Luc Fillaudeau, Nathalie Gorret, Carole Molina
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie Microbienne et Enzymatique
• Date : Soutenance le 29/06/2017
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés - Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés / LISBP
• Jury : Président / Présidente : Cecile Neuveglise
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Luc Fillaudeau, Nathalie Gorret, Carole Molina
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hela Kallel, Jack Legrand

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bioréacteurs

Morphologie cellulaire

Microorganismes -- Métabolisme

Chémostats

Yarrowia lipolytica

Mots clés libres

Yarrowia lipolytica

Batch

Chemostat

Réponse dynamique

Métabolisme

Morphologie

Perturbation

Stress pH

Disponibilité d’oxygène

Yarrowia lipolytica

Batch

Chemostat

Dynamic response

Metabolism

Morphology

Perturbation

PH stress

Oxygen availability

Résumé

En raison des capacités de mélange limitantes, des hétérogénéités au sein des bioréacteurs se produisent régulièrement lors de l’extrapolation à l’échelle industrielle. En conséquence, les microorganismes circulant au sein de ces bioréacteurs sont continuellement exposés à des gradients locaux au niveau des paramètres fondamentaux du procédé tel que le pH, la température, la concentration en substrat et en oxygène dissous. Ces fluctuations micro-environnementales peuvent affecter la croissance, le métabolisme et la morphologie des cellules, en fonction de la nature, de l’intensité, de la durée et/ou de la fréquence de la perturbation rencontrée. L’objectif de ce travail est l’étude quantitative de l’impact des fluctuations de pH et d’oxygène dissous sur le comportement dynamique de Yarrowia lipolytica, une levure avec un potentiel biotechnologique prometteur, aussi bien aux niveaux morphologique que métabolique. Pour répondre à cet objectif, des cultures en bioréacteur en conditions d’environnement contrôlé ont été mises en œuvre afin d’établir un lien de causalité directe entre la perturbation et la réponse observée. L’implémentation de deux modes de cultures différents (batch et chemostat) a permis de caractériser le comportement dynamique des populations cellulaires dans des états physiologiques différents: En mode continu, toutes les cellules sont dans le même état physiologique et se multiplient à la même vitesse de croissance, tandis que des sous-populations de levures dans des états physiologiques distincts peuvent cohabiter dans les cultures en mode batch. Un effort important a été consacré au développement et validation des méthodes pour une quantification rigoureuse des évolutions morphologiques de Y. lipolytica à l’échelle de la population. Le comportement macroscopique de la levure a été caractérisé par l’évaluation des dynamiques de croissance, la viabilité, les vitesses de consommation du glucose et d’oxygène, ainsi que les vitesses de production d’acide organique et de dioxyde de carbone. Trois techniques, à savoir la cytométrie en flux (CYT), la morpho-granulométrie (MG) et la diffraction dynamique de la lumière (DLS) ont été employé pour la quantification du phénomène d’élongation. Les résultats obtenus démontrent qu’il n’y a pas d’effet significatif des fluctuations de pH et d’oxygène dissous sur le comportement macroscopique (vitesses spécifiques, rendements, viabilité) de la levure. Néanmoins, une transition micellaire a été induite en réponse aux deux facteurs de stress (pH and pO2) seulement en conditions d’excès de glucose, suggérant ainsi un impact de la concentration résiduelle de glucose sur la régulation de dimorphisme chez Y. lipolytica. Le contrôle et la régulation de la concentration de glucose dans le milieu peut contribuer à une meilleure maitrise des changements morphologiques de Y. lipolytica en réponse à des stimuli de l’environnement.

Due to limited mixing capacities, heterogeneities regularly occur when scaling-up bioreactors for large-scale production. Microbial cultures are continuously exposed to local gradients in fundamental process parameters such as substrate, pH, temperature and dissolved oxygen DO concentration. These micro-environmental fluctuations may have detrimental effects on cellular growth, metabolism and morphology, depending on the nature, intensity, duration and/or frequency of the fluctuations encountered. The aim of this study was to investigate the impact of pH and DO fluctuations on the dynamic behavior of Yarrowia lipolytica, a microorganism with a promising biotechnological potential, at both morphological and metabolic levels. For this purpose, batch and continuous cultivations modes were preferentially adopted, as it enabled respectively, the study of the stress response of yeast populations growing at their maximum specific rate, and at various controlled specific growth rates in physiological steady-states. In addition, an important effort was devoted to the development and validation of morphological methods in order to acquire quantitative characterization of the response dynamics at the population scale. The macroscopic behavior of Y. lipolytica was assessed through examining the patterns of growth, viability, glucose uptake, oxygen consumption, organic acid and carbon dioxide production rates. Changes in the yeast morphology were characterized at the cell population level by means of flow cytometry, morphogranulometry and diffraction light scattering techniques. The results reflected no significant effect of pH and DO fluctuations on the macroscopic behavior (specific rates, yields, viability) of the yeast. Nevertheless, mycelial growth was induced upon exposure to both stressors, only in glucose-excess environments, suggesting therefore an impact of glucose levels on the regulation of dimorphic transition in Y. lipolytica. Controlling residual glucose concentrations in Y. lipolytica fermentations may contribute to a better monitoring of its morphological changes in response to environmental stimuli. Such data would help to optimize bioprocess performances at the industrial scale since it alleviates physico-chemical impacts due to filamentous cells.