Étude quantitative des basses concentrations de DnaA dans Escherichia coli, en utilisant le système d’expression uhp

Quantitative study of the effects of low DnaA concentrations in Escherichia coli, using the uhp pathway as an inducible expression system

• Auteur / Autrice : Bernard Chelli Ponce de Leon
• Direction : Irina Mihalcescu, Johannes Geiselmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance le 25/04/2017
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble, Isère, France ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (Grenoble, Isère, France ; 1966-....)
• Jury : Président / Présidente : Hidde de Jong
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Meriem Elkaroui, Thierry Vernet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : David Bensimon, Bianca Sclavi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génie génétique

Stéréologie

Escherichia coli

Mots clés libres

Microscopie quantitative

Analyse de données

Microfluidique

Cellule individuelle

Escherichia coli

Ingénierie Génétique

Quantitative microscopy

Data analysis

Microfluidic

Single cell

Escherichia coli

Genetic Engineering

Résumé

La protéine DnaA, ou un homologue, est présente dans la plupart des organismes vivants parce qu'elle joue un rôle clé pour la réplication de l'ADN. Dans Escherichia coli, l'expression de DnaA, l'initiateur central de la réplication de l'ADN, est donc étroitement régulée. Des études antérieures ont montré qu'une forte surexpression de cette protéine conduit à une diminution de la viabilité cellulaire, alors que son absence induit l'arrêt de la division cellulaire. Même si ces conditions extrêmes sont bien étudiées, la transition entre l'arrêt de la division et la croissance normale n'a pas été analysée quantitativement.Nous avons modifié génétiquement Escherichia coli pour mettre l'expression de l'ARN polymérase et de DnaA sous le contrôle deux systèmes inductibles distincts. Pour contrôler l’expression de DnaA, nous avons utilisé un système d’induction se trouvant déjà dans la cellule, le système uhp. Le promoteur du gène uhpT est induit par le glucose-6-phosphate extracellulaire. Nous avons tout d’abord étudié les caractéristiques d’induction de ce système et ensuite caractérisé les phénomènes biologiques déclenchées par les variations de la concentration de DnaA. Les méthodes utilisées combinent des mesures sur une population des bactéries, avec celles en cellule unique, en utilisant la microscopie in vivo en temps réel et des systèmes microfluidiques. Les expériences de microscopie révèlent des phénomènes stochastiques en raison du faible nombre de molécules des composants du système d'induction uhp. En corrélant les observations de population et de cellules uniques, nous donnons une interprétation quantitative du comportement observé. Comme une application potentielle de notre système de contrôle, nous envisageons la possibilité d’arrêter la division cellulaire afin de transformer la cellule en un «sac d'enzymes» pour la production biotechnologique de métabolites.

The DnaA protein, or a homologue, is present in most living organisms because it plays a key role for DNA replication. In Escherichia coli, the expression of DnaA, the central initiator of DNA replication, is therefore tightly regulated. Previous studies have shown that a large overexpression of this protein leads to a decrease in cell viability, while its absence induces the arrest of cell division. Even though these extreme conditions are well studied, the transition from division arrest to normal growth has not been quantitatively analyzed.We genetically engineered Escherichia coli to put the expression of RNA polymerase and the expression of DnaA under the control of two distinct, inducible systems. For the control of DnaA expression, we used a regulatory system already present in the cell, the uhp system. The promoter of the uhpT gene is induced via extracellular glucose-6-phosphate. We characterized the induction characteristics of this system and studied the biological phenomena triggered by varying concentrations of DnaA, using population measurements and single cell, time lapse microscopy of microcolonies or cells grown in a microfluidics device. The microscopy experiments reveal stochastic phenomena due to the low number of molecules of components of the induction system and of DnaA. Confronting population and single cell observations we are able to give a quantitative interpretation of the observed behavior. As a potential application of our control system, we explored the possibility of freezing cell division in order to turn the cell into a “bag of enzymes” for the biotechnological production of metabolites.