Micro-impression de BMP-2 et fibronectine sur des matériaux mous : un outil pour recréer la niche de cellules souches in vitro

Micropatterns of BMP-2 and fibronectin on soft materials : a tool for recreating the stem cell niche in vitro

• Auteur / Autrice : Vincent Fitzpatrick
• Direction : Catherine Picart, Thomas Boudou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Matériaux, Mécanique, Génie civil, Electrochimie
• Date : Soutenance le 16/10/2017
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ingénierie - matériaux mécanique énergétique environnement procédés production (Grenoble ; 2008-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des matériaux et du génie physique (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Franz Brückert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Crouzier, Elena Martinez Fraiz
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Benoît Ladoux, Céline Colnot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biomatériaux

Ostéoblastes

Cytosquelette

Cellules -- Adhésivité

Mots clés libres

Biomatériaux

Bioingénierie

.Micro-Impression

Biomaterials

Bioengineering

Micropatterning

Résumé

In vivo, les cellules souches résident au sein de niches, des microenvironnements extrêmement spécialisés qui leur permettent de réguler leur prolifération ainsi que leur différentiation en cellules matures et fonctionnelles. Ces microenvironnements sont caractérisés par des interactions cellules-cellules, la présence de facteurs de croissance et de cytokines, et une matrice extracellulaire, qui fournissent des signaux qui permettent de contrôler le comportement des cellules souches.Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) est un facteur de croissance ostéoinductif qui est impliqué dans toutes les étapes de la différentiation ostéoblastique, ainsi que dans la transdifférentiation de myoblastes vers une lignée ostéogénique. In vivo, ce facteur existe à la fois en solution et lié à la matrice extracellulaire. Bien que ces deux modes de présentation influencent les comportements cellulaires de façon distincte, leur rôle dans le microenvironnement de la niche et leur pertinence fonctionnelle dans la genèse de la réponse biologique n’a presque pas été étudié à l’échelle cellulaire. Ici nous avons utilisé l’affinité naturelle de la BMP-2 pour la fibronectine afin de créer des micromotifs de BMP-2 de taille cellulaire sur des biomatériaux mous.Cette technique nous a permis de contrôler simultanément la présentation spatiale de la BMP-2 liée à la fibronectine, ainsi que l’étalement cellulaire. Ces micromotifs ont induit une organisation d’actine et d’adhésions focales autour du noyau, et a déclenché la phosphorylation et la translocation nucléaire de SMAD1/5/8 dans des myoblastes murins C2C12 et des cellules souches mésenchymateuses. Ceci est un indicateur précoce de leur transdifférentiation ostéoblastique. Nous avons trouvé que l’étalement cellulaire lui-même facilitait la phosphorylation de SMAD1/5/8 dépendante de la BMP-2, et avons démontré que la signalisation SMAD médiée par la fibronectine et la BMP-2 dépendait de LIM kinase 2 et de ROCK, plutôt que d’une activation de la myosine II.Nous avons également pu utiliser cet outil pour étudier les cinétiques d’adhésion et d’étalement, les changements d’organisation du cytosquelette dépendants du mode de présentation de la BMP-2, et la signalisation entre la matrice et la cellule, médiée par les intégrines. Nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant un effet du mode de présentation de la BMP-2 sur les forces cellulaires, suggérant que le mode de présentation des facteurs de croissance pourrait être pertinent à d’autres mécanismes cellulaires tels que la mécanotransduction.Dans l’ensemble, nous résultats montrent que les patterns de BMP-2 liée à la fibronectine sont un outil utile à l’étude de mécanismes cellulaires. De façon plus large, notre approche pourrait être adaptée à d’autres combinaisons de protéines de la matrice et de facteurs de croissance, ouvrant ainsi une avenue fascinante pour recréer in vitro des niches spécifiques aux tissus.

In vivo, stem cells reside within niches, highly specialized microenvironments which allow them to regulate their self-renewal and differentiation into mature and functional cells. These microenvironments are characterized by cell-cell interactions, the presence of growth factors and cytokines, and an extracellular matrix, all of which provide cues that control stem cell behavior.Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is an osteoinductive growth factor which is involved in all stages of osteoblastic differentiation, as well as the transdifferentiation of myoblasts toward an osteogenic lineage. In vivo, it exists both in solution and bound to the ECM. While these two modes of presentation are known to influence cell behavior distinctly, their role in the niche microenvironment and their functional relevance in the genesis of a biological response has sparsely been investigated at a cellular level. Here we used the natural affinity of BMP-2 for fibronectin (FN) to engineer cell-sized micropatterns of BMP-2 on soft biomaterials.This technique allowed the simultaneous control of the spatial presentation of fibronectin-bound BMP-2 and cell spreading. These micropatterns induced a specific actin and adhesion organization around the nucleus, and triggered the phosphorylation and nuclear translocation of SMAD1/5/8 in C2C12 myoblasts and mesenchymal stem cells, an early indicator of their osteoblastic transdifferentiation. We found that cell spreading itself potentiated a BMP-2-dependent phosphorylation of SMAD1/5/8, and demonstrated that FN/BMP-2-mediated early SMAD signaling depended on LIM kinase 2 and ROCK, rather than myosin II activation.We were also able to use this tool to investigate adhesion and spreading kinetics, changes in cytoskeletal organization depending on BMP-2 presentation mode, and reciprocal integrin-mediated signaling between the ECM and the cell. We were able to show preliminary results suggesting an effect of BMP-2 presentation mode on cellular forces, suggesting that growth factor presentation may be relevant to other cellular mechanisms like mechanotransduction.Altogether, our results show that FN/BMP-2 micropatterns are a useful tool to study the mechanisms underlying BMP-2-mediated mechanotransduction. More broadly, our approach could be adapted to other combinations of ECM proteins and growth factors, opening an exciting avenue to recreate tissue-specific niches in vitro.