Optimisation de la production d’acides gras inhabituels chez la levure Yarrowia lipolytica par fermentation de substrats bio-sourcés

Optimization of the production of unusual fatty acids in yeast Yarrowia lipolytica by fermentation of bio-based substrates

• Auteur / Autrice : Nabila Imatoukene
• Direction : Jean-Marc Nicaud, Maurice Nonus
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie des Procédés Industriels et Développement Durable : Transformations intégrées de la matière renouvelable (EA-4297)
• Date : Soutenance le 29/05/2017
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Huile de soja

Cultures cellulaires

Levure (agent de fermentation)

Fermentation

Lipides -- Métabolisme

Cyclopropane

Acides gras

Linoléique, Acide

Yarrowia lipolytica

Mots clés libres

Métabolisme lipidique

Conditions de culture

Acides linoléiques conjugués

Acides gras cyclopropanes

Yarrowia lipolytica

Conjugated linoleic acids (CLA)

Cyclopropane fatty acids (CFA)

Lipid metabolism

Culture conditions

Fatty acids

Fermentation

Yeast

Soy oil

Culture media

Résumé

Les acides linoléiques conjugués (CLA) et les acides gras cyclopropanes (CFA) sont deux types d’acides gras à haute valeur ajoutée. Ils présentent un grand intérêt dans divers domaines agroalimentaire ou industriel. Les CLA sont connus pour leurs effets bénéfiques pour la santé, alors que les CFA constituent une bonne source pour la fabrication de lubrifiants, plastiques…après leur hydrogénation. Les CLA sont synthétisés par voie chimique qui génère différents types d’isomères. Les CFA sont produits par les plantes dépendantes du climat et les bactéries présentant naturellement de faibles productivités. Il semble donc intéressant de chercher des alternatives pour leurs productions. Y. lipolytica constitue une bonne alternative. Ceci passe par des modifications génétiques pour permettre ces synthèses et l’étude de l’influence des conditions de culture. Pour cela, les voies de synthèse de ces deux acides gras ainsi que les éléments qui peuvent influencer leurs productions sont à acquérir. Dans ce contexte, nous avons testé plusieurs souches possédant différentes modifications génétiques en erlenmeyer et en fermenteur sur le milieu de néo-synthèse et de bioconversion. Une souche a été sélectionnée permettant la diminution de la dégradation des CLA par le blocage de la voie de la β-oxydation. La meilleure production de CLA en fermenteur a été obtenue en présence d’huile de soja et grâce à la surexpression du gène FAD2 (302 mg. L-1). L’influence de la composition et des paramètres de culture a été étudiée. Les résultats ont montré une meilleure assimilation de la peptone de Soja Dynamis riche en acides aminés libres par la levure qui conduit à une productivité améliorée. Ceci par son effet positif sur la croissance et les productions. De plus, la stratégie Fed-batch en fermenteur a permis la production optimale de CLA (0,4 g.L-1), la limitation en azote et phosphore semble affecter leur accumulation. D’autres souches dites de premières générations productrices de CFA grâce à l’expression du gène de la CFAs d’E.coli ont été testées sur différents milieux de culture. Deux souches (GY1005 et GY1070) ont été retenues pour leur production maximale d’huile et/ou de CFA sur le milieu de néo-synthèse en fermenteur. Ceci grâce à la surexpression des gènes DGA2 et GPD1 permettant une forte accumulation de lipides et l’absence de remobilisation et de dégradation des acides gras. Les paramètres et la composition du milieu de culture tels qu’une forte agitation (1 000 rpm) et une stratégie Fed-batch en utilisant une solution de même composition que le milieu de départ ont permis de maximiser la production de CFA (1,2 g.L-1 pour GY1070 et 0,9 g.L-1 pour GY1005). Une souche dite de deuxième génération (JMY5578) a été optimisée génétiquement (expression du gène de la CFAs sous le contrôle d’un promoteur plus fort et l’expression du gène LRO1). Cette souche a été testée en erlenmeyer et en fermenteur dans le but d’évaluer l’influence des composés du milieu de culture sur la production de CFA. Les résultats ont montré un gain de 30% de CFA et 6% de biomasse en présence des chlorures de magnésium et des vitamines dans le milieu de culture. De plus, un ajout en continu de dextrose et un milieu de départ riche en azote et phosphore a permis une production de 3 g.L-1 de CFA. Nous avons étudié l’impact des promoteurs sur l’expression du gène de la CFAs dans des souches de 2éme génération. L’expression du gène sous le contrôle du promoteur php8d a donné le meilleur résultat en termes d’accumulation des CFA dans la souche JMY6068 (46% dans les lipides totaux) ; il semble être le promoteur le plus fort en comparaison avec TEF.

Conjugated linoleic acids (CLA) and cyclopropane fatty acids (CFA) are two high value added products. They are of a great interest in various agri-food or industrial fields. CLAs are known for their health benefits, while CFAs, after their hydrogenation are a good source for the manufacture of lubricants, plastics.... CLAs are synthesized chemically which generates different types of isomers. CFAs are produced by climate-dependent plants and by bacteria with low productivity. It seems therefore interesting to look for alternatives for their production. Y. lipolytica is a good alternative. This involves genetic modifications to enable these syntheses and the study of the influence of culture conditions. For this purpose, synthetic pathways of these two fatty acids as well as the elements that can influence their production are to be acquired. In this context, we tested several strains with different genetic background in flask and fermenter on neo-synthesis and bioconversion media. One strain was selected allowing reduction of CLA degradation by blocking the β-oxidation pathway and the better production of CLAs in fermenter with soybean oil by overexpression of FAD2 (302 mg. L-1). The influence of media composition was studied. The results showed better assimilation of Dynamis soy peptone rich in free amino acids by this yeast. This has a positive effect on growth and productions. In addition, the Fed-batch fermenter strategy allowed the optimal production of CLA (0.4 g. L-1), and nitrogen and phosphorus limitations seems to affect their accumulation. First generation strains producing CFA by expression of the CFA gene of E. coli were studied. They were tested on different culture media. Two strains (GY1005 and GY1070) were retained for their maximum oil production and/or CFA accumulation on neosynthesis medium in fermenter. This is due to DGA2 and GPD1 genes overexpression allowing a strong lipid accumulation and in the absence of remobilization and degradation of fatty acids. Media composition and culture parameters, such as strong stirring (1 000 rpm) and a Fed-batch strategy using a solution with the same composition as the starting medium, made it possible to maximize CFA production (1.2 g. L-1 for GY1070 and 0.9 g. L-1 for GY1005). A so-called second generation strain (JMY5578) was genetically optimized (CFA gene was expressed under the control of a stronger promoter and LRO1 over-expression gene). This strain was tested in flask and fermenter in order to evaluate the influence of culture medium compounds on CFA production. The results showed a gain of 30% CFA and 6% biomass in the presence of magnesium chloride and vitamins in the culture medium. In addition, a continuous addition of dextrose in fermenter and a nitrogen and phosphorus-rich starting medium allowed production of 3 g.L-1 of CFA. We also looked at the effect of promoters for the CFA gene expression in secondgeneration strains. Expression of the gene under the control of the php8d promoter gave the best result in terms of CFA accumulation in JMY6068 strain (46% in total lipids) and appears to be the strongest promoter in comparison with TEF.