Caractérisation in vitro des comportements immunomodulateurs différentiels d'une bactérie probiotique Lactobacillus rhamnosus Lcr 35 et d'un pathogène vaginal, Gardnerella vaginalis

In vitro characterization of the differential immunomodulatory behaviors of a probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus Lcr 35 and a vaginal pathogen, Gardnerella vaginalis

• Auteur / Autrice : Thomas Bertran
• Direction : Bertrand Evrard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 10/07/2017
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne‎ (2017-2020)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de nutrition humaine (Clermont-Ferrand)
• Jury : Président / Présidente : Florence Fenollar
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Gueirard, Jean-Marc Chatel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Corinne Grangette, Christian Drouet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vaginose bactérienne

Probiotiques

Mots clés libres

Vaginose bactérienne

Probiotiques

Bacterial vaginosis

Probiotics

Résumé

La vaginose bactérienne (VB) est une infection génitale basse considérée comme une dysbiose de la flore vaginale, avec diminution des lactobacilles protecteurs et colonisation par une flore poly- microbienne anaérobie, au sein de laquelle Gardnerella (G.) vaginalis tient un rôle prépondérant. Les probiotiques, dont le Lactobacillus rhamnosus Lcr35, trouvent une bonne indication dans cette pathologie, en permettant de restaurer la flore vaginale et de diminuer le taux de récidive des VB, problème récurrent survenant après traitement antibiotique du fait de la persistance d’une altération de la flore. Cependant, l’effet de ces bactéries bénéfiques sur le système immunitaire, est mal connu. Les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle critique dans ce système en orchestrant les réponses immunitaires adaptatives, tolérogènes ou inflammatoires. A l’état immature, ces cellules assurent la surveillance et la protection des muqueuses, notamment intestinales et vaginales, par la reconnaissance de produits microbiens, les PAMP via leurs récepteurs membranaires appelés les PRR. Une fois l’antigène microbien capté, les DC subissent un processus de maturation et s’activent, permettant ainsi la polarisation lymphocytaire T CD4 + et la génération des sous-populations effectrices Th1, Th2 et Th17 ou tolérogènes, les T régulateurs. L’objectif de ce travail était donc d’étudier in vitro, sur une large gamme de concentrations, les propriétés immunomodulatrices différentielles de G. vaginalis et du Lcr35 sur les réponses des DC et lymphocytaire T afin de mieux caractériser les effets propres à chaque souche et de confirmer ou non la pertinence, d’un point de vue immunologique, d’utiliser ce probiotique dans le traitement de la vaginose bactérienne. Par microscopie électronique, nous avons montré que G. vaginalis réduisait les capacités d’internalisation des DC en formant des amas, induisant une faible maturation de ces cellules et une faible sécrétion de cytokines anti- et pro- inflammatoires, en testant un large panel par technologie Luminex. De même, sur les lymphocytes T, G. vaginalis induisait peu de prolifération et sécrétion de cytokines. Prises ensemble, nos données indiquent que G. vaginalis possèdent in vitro des propriétés immunomodulatrices peu intenses contre les DC et les lymphocytes T, induisant une réponse inflammatoire de bas grade, qui pourrait, de manière intéressante, bien concorder avec la clinique atypique de la VB, par nature peu inflammatoire. Au contraire, le Lcr35 est fortement internalisé par les DC conduisant à une maturation dose-dépendante et une sécrétion significative de cytokines essentiellement pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF-α...). La prolifération lymphocytaire est significativement augmentée aux faibles concentrations de Lcr35, avec un pic à 10 5 CFU/mL associé à une production d’IFN-γ, cytokine pro-Th1 et à une activation maximum de l’IDO. Le Lcr35 semble ainsi posséder des propriétés immunostimulatrices importantes et pourrait ainsi induire une réponse pro-inflammatoire, pro-Th1. Pour conclure, ce profil pourrait donc potentiellement être efficace pour lutter localement contre les effets de G. vaginalis, en restaurant une meilleure réponse inflammatoire. Cette hypothèse, que nous avons dénommée « effet Booster » reste à confirmer dans des études complémentaires. Dans un futur proche, nous avons ainsi prévu de réaliser de nouvelles expériences, dans lesquelles nous étudierons l’effet de ces deux bactéries dans un modèle de polarisation autologue à partir de DC et de lymphocytes CD4 + naïfs, les voies de signalisation intracellulaire impliquées dans les résultats observés, l’effet de la co-incubation des deux bactéries sur ces mêmes cellules et enfin l’effet de la composante épithéliale grâce à des modèles Transwell® associant les cellules épithéliales aux cellules immunitaires.

Bacterial vaginosis (BV) is a low genital infection considered as vaginal flora dysbiosis, with protective Lactobacillus decreased and an anaerobic poly-microflora colonization, within Gardnerella (G.) vaginalis as a major role. Probiotics, Lactobacillus rhamnosus Lcr35 included, have a good indication in this pathology, allowing vaginal flora restoration and decreased BV recurrence rate, one of the major problem of this dysbiosis that appears after an antibiotic treatment due to flora alteration persistence. However, bacterial effects on immune system, which goal is to defend against lots of attacks, infectious ones included, is scarcely known. Dendritic cells (DC) play a critical role in this system orchestrating adaptive immune response, tolerogenic or inflammatory ones. At the immature states, DCs monitors and protects mucosae (especially intestinal and vaginal ones) recognizing microbial products called PAMP, via their membrane receptors, called PRR. Once, the microbial antigen captured, DCs are activated and start a maturation process, which permits CD4+ T cells polarization and effectors T cells, Th1, Th2 and Th17 or tolerogenic T cells, Treg, generation. The main objective of this work was to study in vitro, over a wide range of concentrations, G. vaginalis and Lcr35 immunomodulatory properties on DCs and T cells response (Lymphoblastic transformation test and mixed leucocyte reaction) in order to better characterize specific strains effects and to confirm, in an immunological perspective, the relevance of using this probiotic in BV treatment. By Electron microscopy, we showed that G. vaginalis diminished DCs internalization capacity by forming clusters, causing a slight maturation of these cells and also a slight anti- and pro-inflammatory cytokines secretion by Luminex technology. Similarly, about T cells, G. vaginalis induced few proliferation and cytokines secretion. Altogether, our data suggests that in vitro G. vaginalis possesses weak immunomodulatory properties against DCs and T cells, inducing a low grade inflammatory response, which interestingly, might be tied in to the atypical clinical signs of BV, which being almost non-inflammatory is a specificity. On the contrary, Lcr35 is well internalized by DC causing a dose-dependent maturation and a significant essentially pro-inflammatory (IFN-γ, TNF-α...) cytokines secretion. Lymphocytic proliferation, is significantly increased at low Lcr35 concentrations reaching a peak at 105 CFU/mL which is associated with IFN-γ production, a pro-Th1 cytokine. Thus, Lcr35 seems to have important immunostimulatory properties and might induce a pro- inflammatory and pro-Th1 response and a maximum IDO activity. To conclude, this profile might potentially be locally efficient against G. vaginalis effects, restoring a better quality vaginal inflammatory response. This hypothesis, we named “booster effect” has to be confirmed with in vitro, animals model and in vivo complementary studies. Some complementary new experiments have been planned in the near future, in which we will study the effect of these two bacteria in an autologous polarization model from DCs and naïve CD4+ T cells, intracellular signalization involved in previous results, the effect of these two bacteria co-incubation over these cells and finally the effect of the epithelial component through the Transwell® model whiwh associates apithelial to immune cells.