Développement d’un microréacteur biomimétique pour l'analyse in situ d'activités enzymatiques par couplage de l’électrochimie et de la microscopie de fluorescence

Development of a single biomimetic microreactor for enzymatic activities in situ analyzes by coupling electrochemistry and fluorescence microscopy

• Auteur / Autrice : Pauline Lefrançois
• Direction : Stéphane Arbault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 30/11/2017
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences Moléculaires (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Sébastien Lecommandoux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Arbault, Sébastien Lecommandoux, Miglena Angelova, Fethi Bedioui, Olivier Buriez, Marie-Pierre Rols, Jérôme Santolini
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Miglena Angelova, Fethi Bedioui

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Électrochimie

Espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

Monoxyde d'azote

Peroxyde d'hydrogène

NO-synthase

Liposomes

Chimie biomimétique

Microréacteurs chimiques

Enzymes

Mots clés libres

Liposomes

Biomimétisme

Enzymes

Glucose oxydase

NO-Synthase

Espèces réactives de l’oxygène et de l’azote

Peroxyde d’hydrogène

Monoxyde d’azote

Liposomes

Biomimicry

Enzymes

Glucose oxidase

NO-Synthase

Reactive Ox-ygen and Nitrogen Species

Hydrogen peroxide

Nitric oxide

Résumé

De nombreuses réactions enzymatiques sont à l’origine de processus physiologiques au sein des organismes vivants. Ces réactions sont basées sur des transferts de protons et d’électrons et con-duisent souvent à la production d’espèces secondaires. Parmi elles, les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS, RNS) présentent un intérêt particulier puisqu’elles jouent un double rôle : d’une part en permettant à l’organisme de réagir à un stress par l’activation de voie de signalisation redox, et d’autre part ces ROS et RNS peuvent causer des dommages tissulaires et être à l’origine de dys-fonctionnement (stress oxydant) au sein de l’organisme. La haute réactivité de ces espèces induit leurs faibles durées de vie (ns-min) et rend l’étude de certaines réactions enzymatiques difficiles en solu-tion. Ce projet de thèse a pour objectif de développer un microréacteur biomimétique pour l’étude d’activités enzymatiques produisant des ROS/RNS. En effet, en confinant une réaction au sein d’un compartiment de taille équivalente à celle d’une cellule (20-100 μm de diamètre), les espèces générées (H2O2, NO•, NO2-) doivent pouvoir être sondées in situ avec une résolution cinétique et quantitative. Des vésicules unilamellaires géantes sont formées en conditions physiologiques et servent de micro-réacteurs pour l’analyse des activités enzymatiques de la glucose oxydase et des NO-synthases. La microscopie de fluorescence permet l’observation des vésicules et le suivi du déclenchement de la réaction assuré par microinjection. Les espèces produites sont ensuite détectées en temps réel par électrochimie afin de déchiffrer à terme les différentes voies enzymatiques des NO-Synthases.

Enzymatic reactions are involved in many physiological phenomena in living organisms. These reactions are based on protons and electrons transfers and can lead to the production of by-products. Among them, reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS) are of great interest as they play a double role: on the one hand by allowing the organism to react to a stress by the activation of signaling redox pathways, and on the other hand, ROS and RNS can cause oxidative damages to tissues ensuing dysfunctions in the organism. The high reactivity of such species induce their short lifetimes (ns-min) and leads to uncertainties when it comes to the study of some enzymatic reactions in bulk. This PhD project aims to develop a biomimetic microreactor for the study of enzymatic ac-tivities producing ROS/RNS. Indeed, by confining a reaction within a cell-sized compartment (20-100 μm diameter), the generated species (H2O2, NO•, NO2-) could be analyzed in situ with a quantita-tive and kinetic resolution. Giant unilamellar vesicles are formed in physiological conditions and are used as microreactors for the monitoring of enzymatic activities of glucose oxidase and NO-synthases. Fluorescence microscopy allows individual vesicle observation and the monitoring of reactions trig-gered by microinjection. Then, released species are detected in real-time by electrochemistry in order to decipher the diverse enzymatic pathways of NO-Synthases.