Recherche ou développement, et caractérisation fonctionnelle et structurale d'effecteurs peptidiques de deux récepteurs membranaires à incidences physiopathologiques

Research or development, and functional and structural characterization of peptidic effectors of two membrane receptors with pathophysiological incidences

• Auteur / Autrice : Lamia Mebarki
• Direction : Pascale Marchot, Ghérici Hassaïne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale
• Date : Soutenance le 03/10/2017
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : James N. Sturgis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Edouard Bougis
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Louis Banères, Denis Servent

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sérotonine

Vasopressine

Résonance plasmonique de surface

Microscopie électronique

Mots clés libres

Agent thérapeutique

Domaine variable d’anticorps à chaine lourde (VHH)

Récepteur à la vasopressine V1b (V1bR)

Voie métabolique

Microscopie électronique (ME)

Modulateur allostérique positif (PAM)

Récepteur 5-HT3 (5-HT3R)

Résonance plasmonique de surface (SPR)

Toxine peptidique.

Allosteric positive modulator (PAM)

5-HT3 receptor (5-HT3R)

Metabolic pathway

Peptidic toxin

Single-Domain antibody fragment (VHH)

Therapeutic agent

V1b receptor (V1bR)

Surface plasmon resonance (SPR).

Résumé

Les récepteurs à la vasopressine V1bR et à la sérotonine 5HT3R jouent des rôles physiologiques importants dans la détection des signaux extracellulaires, les mécanismes de transmission nerveuse et diverses pathologies dont le cancer, le diabète et des maladies des SNC et SNP. Mes études avaient pour but de générer ou trouver des modulateurs peptidiques de ces deux récepteurs. Pour le V1bR, j’ai développé plusieurs anticorps de type VHH et les ai caractérisés aux plans biochimique et fonctionnel. L’un de ces VHHs agit comme un agoniste allostérique complet et spécifique du V1bR humain (hV1bR). In vitro ce VHH est capable d’activer les voies de signalisation de l’inositol phosphate et des MAP kinases et d’induire l'internalisation du hV1bR. Dans des îlots pancréatiques surexprimant le hV1bR, il induit une augmentation du Ca2+ intracellulaire et une sécrétion d'insuline. Pour le 5HT3R, j’ai criblé par SPR 31 venins de serpents sur des récepteurs recombinants immobilisés et mis en évidence une interaction à partir d’un de ces venins. Suite à purification par chromatographie liquide et identification par spectrométrie de masse, j’ai identifié une toxine préalablement caractérisée comme une enzyme à activité Ca2+-dépendante. Cette toxine interagit avec les 5HT3R A et AB indépendamment du Ca2+ et avec des valeurs de Kd ≤ 10 nM. L’analyse fonctionnelle par électrophysiologie suggère qu’elle agit comme un PAM de l’activité canal du 5HT3R. Des images de ME en coloration négative montrent la toxine fixée sur le domaine extracellulaire du 5HT3R, à distance du site pour la 5HT. Le VHH et la toxine pourraient être utilisés comme outils pharmacologiques et/ou agents thérapeutiques.

The vasopressin V1bR and serotonin 5HT3R receptors play important physiological roles in the detection of extracellular signals, in the mechanisms for neuronal transmission, and in various pathologies including cancer, diabetes, and CNS and PNS diseases. My studies were aimed at generating or finding peptidic modulators of these two receptors. For the V1bR, I developed several antibodies of the VHH type and characterized them biochemically and functionally. One of these VHHs acts as a complete allosteric agonist specific for the human V1bR (hV1bR). In vitro this VHH is able to activate the signaling pathways of inositol phosphate and MAP kinases and to induce the internalization of hV1bR. In pancreatic islets overexpressing hV1bR, it induces an increase in intracellular Ca2+ and a secretion of insulin. For the 5HT3R, using SPR I screened 31 snake venoms on immobilized recombinant receptors and for one of these venoms, evidenced an interaction. Following purification by liquid chromatography and identification by mass spectrometry, I identified a toxin previously characterized as an enzyme with Ca2+-dependent activity. This toxin interacts with the 5HT3R A and AB independently of Ca2+ and with Kd values ≤ 10 nM. Functional analysis by electrophysiology suggests that it acts as a PAM of the 5HT3R channel activity. Images recorded by negative staining EM show that the toxin binds to the 5HT3R extracellular domain, at a distance from the 5HT binding site. Both this VHH and this toxin could be used as pharmacological tools and / or therapeutic agents.