Altérations génétiques et réponse thérapeutique dans les adénocarcinomes pulmonaires

par Nicolas Pécuchet

Thèse de doctorat en Biologie moléculaire

Sous la direction de Pierre Laurent-Puig.

Soutenue le 15-11-2016

à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....) , en partenariat avec Université Paris Descartes (1970-2019) (établissement de préparation) et de Médecine Personnalisée- Pharmacogénomique- Optimisation Thérapeutique / MEPPOT - U1147 (laboratoire) .

Le président du jury était Denis Moro-Sibilot.

Le jury était composé de Pierre Laurent-Puig, Denis Moro-Sibilot, Jacques Cadranel, Thierry Frébourg, Hélène Blons, Elizabeth Fabre-Guillevin.

Les rapporteurs étaient Jacques Cadranel, Thierry Frébourg.

mots clés

• Cancer pulmonaire
• Facteur pronostique
• STK11
• ADN plasmatique
• ADN tumoral circulant
• Poumon -- Cancer non à petites cellules
• ADN tumoral

Résumé

Nos travaux de recherche avaient pour objectif d’optimiser et de personnaliser la prise en charge des patients atteints de cancer pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) grâce à l’étude de des caractéristiques génétiques tumorales. Bien que les mutations STK11 soient l’une des altérations les plus fréquentes des CBNPC, leur impact sur le pronostic des patients opérés est mal connu. Grâce à l’utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS), nous avons caractérisé les mutations STK11 dans une série de 567 patients opérés pour un CBNPC. Nous avons montré que l’impact pronostique des mutations de STK11 dépend de leur position sur le locus: les mutations STK11 des exons 1 et 2 sont associées à un pronostic défavorable alors que les mutations des exons 3 à 9 sont associées à un pronostic similaire à celui des tumeurs STK11 sauvages. Ces résultats sont concordants avec les travaux de recherche pré-cliniques montrant qu’une mutation non-sens sur le premier exon de STK11 induit l’expression d’une isoforme ΔN-STK11 tronquée dans sa partie N-terminale et ayant des propriétés oncogéniques. La caractérisation moléculaire destumeurs est possible grâce à l’ADN circulant. Les mutations somatiques tumorales peuvent être retrouvées dans l’ADN libre circulant, dont une partie provient des cellules tumorales et constitue l’ADN tumoral circulant (ADNtc). Avant la réalisation de notre travail, plusieurs équipes avaient démontré qu’il était possible d’utiliser l’ADNtc comme une alternative à la biopsie pour détecter les mutations avant traitement ou lors de la progression chez des patients atteints d’un CBNPC. Notre objectif était de mettre au point et valider une technique de détection ultra-sensible basée sur le NGS ciblé pour détecter des mutations dans l’ADN circulant, Nous avons développé la méthode BPER (Base Position Error-Rate) qui permet d’analyser les données issues du séquençage avec une plus grande sensibilité que les méthodes actuelles pour un coût identique. A chaque position génomique, la fréquence des A, T, C, G, insertions, délétions observée par le séquençage d’un échantillon plasmatique est comparée individuellement à l’estimation du taux d’erreur observé dans un groupe d’échantillons contrôle. Cet outil bioinformatique a été développé et rendu publique sous la forme d’un package R intitulé « PlamaMutationDetector ». Afin d’évaluer l’utilité clinique de cette méthode, nous avons mené une étude observationnelle prospective chez des patients traités par chimiothérapie ou anti-EGFR pour un CBNPC avancé ou métastatique nouvellement diagnostiqué. Nous avons pu montrer l’impact pronostique défavorable de la présence d’ADNtc avant le début du traitement. Nous avons aussi mis en évidence que la persistance d’une détection d’ADNtc lors de la première évaluation sous traitement (à 6 semaines) était associée à une survie plus courte. Ainsi, l’efficacité thérapeutique pourrait être évaluée par la quantification de l’ADNtc au cours du traitement en complément ou en remplacement de l’évaluation radiologique selon les critères RECIST. La réponse complète biologique pourrait devenir un critère d’évaluation dans les essais thérapeutiques. En conclusion, cette étude a permis de mieux caractériser les CBNPC STK11 mutés sur le plan clinique et de souligner la dualité de fonction potentielle de ce gène suppresseur de tumeur. Ce travail ouvre la voie à la recherche de stratégies thérapeutiques différentes pour chacun des sous groupes de patients. Nous avons développé un outil de détection non invasive des mutations somatiques tumorales dans le plasma et montré l’intérêt clinique de cette nouvelle stratégie de typage. Des études interventionnelles basées sur l’ADNtc comme témoin de la réponse thérapeutique pourront maintenant être réalisées. Enfin, il est probable que l’impact pronostique de l’ADNtc soit encore plus marqué chez les patients porteurs de CBNPC de stade précoce et permette de guider la prise en charge.

mots clés

• Lung cancer
• Prognostic marker
• STK11
• Plasma DNA
• Circulating tumor DNA

Titre traduit

Molecular alterations and their therapeutic impact in lung adenocarcinomas

Résumé

This work focuses on non-small cell lung cancer (NSCLC) molecular characterization to optimize and personalize therapy. Tumor somatic alterations were analyzed in tissue samples and in cell free plasma DNA to identify prognostic and predictive molecular markers. We developed and validated new therapeutic decision tools through these different approaches. STK11 mutations are present in about 25% of NSCLC. Their impact on the prognosis of resected NSCLC has been poorly studied. Using next generation sequencing (NGS) we screened STK11 mutations in a series of 567 resected NSCLC patients. We showed that the prognostic impact of STK11 mutations depends on their location in the locus: STK11 mutations located in exons 1 and 2 were associated with a poor prognosis while mutations located in exons 3 to 9 were associated with a prognosis similar to wild tumours. These results are consistent with preclinical research showing that a nonsense mutation in the first exon of STK11 induces the expression of a ΔN-STK11 truncated isoform with oncogenic properties. Plasma cell free DNA can be used as a substitute to tissue to detect somatic molecular alterations. Indeed, tumour DNA can be released and detected in plasma defining circulating tumour DNA (ctDNA). Prior to our work, several teams had shown that ctDNA was an alternative to biopsy to detect tumor mutations at diagnosis or at time of treatment resistance. The major limitation to ctDNA detection is the sensitivity of the assay. Our goal was to develop an ultra-sensitive detection method based on targeted NGS. We developed the BPER method (Base Position Error-Rate) to analyse sequencing data with a greater sensitivity than current methods at the same cost. At each genomic position, the frequency of A, T, C, G, insertions, deletions detected in a plasma sample is individually compared to the estimated error rate obtained by the sequencing of control samples. This bioinformatics tool was developed and released as an R package called "PlamaMutationDetector". To validate the usefulness of this tool in clinical routine, we conducted a prospective observational study in newly diagnosed advanced NSCLC patients treated with chemotherapy or EGFR inhibitors. We demonstrated the negative prognostic impact of the presence of ctDNA at baseline independently of the classic prognostic factors. We showed that the persistence of ctDNA at the first evaluation during treatment (6 weeks) was associated with a poor survival. Thus, early assessment of therapeutic efficacy may be feasible by ctDNA measurements in addition to or in replacement of the radiological evaluation using RECIST criteria. Clearance of ctDNA could be used in clinical trials as an efficacy endpoint, especially for adjuvant studies. In conclusion, this study allowed better characterization of the effect of STK11 mutations depending on their distribution on the locus. It would be interesting to explore different therapeutic strategies based on the STK11 status. We developed a new non-invasive method to detect plasma mutation with an immediate transfer to the clinic. Interventional studies may help validate the impact of ctDNA in treatment management. Finally, the prognostic impact of ctDNA might also be of importance in patients with localized disease for which surgery or adjuvant therapy is discussed.