Procédé de production de succinate à partir de xylose couplant fermentation (ingénierie métabolique d'Escherichia coli) et purification (nanofiltration)

Reengineering of metabolically engineered escherichia coli to produce succinate from xylose-containing medium and its purification by nanofiltration

• Auteur / Autrice : Panwana Khunnonkwao
• Direction : Hélène Roux-de Balmann, Kaemwich Jantama
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie des procédés et de l'environnement
• Date : Soutenance le 18/11/2016
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Mécanique, énergétique, génie civil et procédés (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de génie chimique (Toulouse ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fermentation

Escherichia coli

Succinate déshydrogénase

Mots clés libres

Succinate

Fermentation

Escherichia coli

Ingénierie métabolique

Xylose

Nanofiltration

Rétention

Separation factor

Succinate

Fermentation

Escherichia coli

Metabolic Engineering

Xylose

Nanofiltration

Retention

Separation factor

Résumé

Les ressources de carbone primaires doivent être progressivement remplacées par des ressources renouvelables plus complexes comme les matières lignocellulosiques, pour produire des biocarburants ou des synthons (bioraffineries de 2ième génération). Cette évolution nécessite de modifications importantes à différentes étapes du procédé, au niveau de la fermentation elle-même ou dans les étapes ultérieures nécessaire pour l'obtention du produit cible. Dans ce travail, nous avons étudié un procédé de production de succinate à partir du xylose. La fermentation a été réalisée en utilisant une souche d' Escherichia coli modifiée par ingénierie métabolique. La purification du succinate a été réalisée par nanofiltration. Des travaux précédents ont permis, par ingénierie métabolique, de mettre au point une souche E. coli KJ122 permettant de produire du succinate par fermentation anaérobie de glucose dans un milieu contenant des sels minéraux. Cette souche ne permet cependant pas une fermentation performante lorsque le xylose est utilisé comme substrat. Afin de lever cette limitation, E. coli KJ122 a été modifiée. Le transporteur ABC codant pour les gènes xylFGH a été inactivé par une technique de suppression de gènes. La souche ainsi obtenue, baptisée KJ12201 (E. coli KJ122 ?xylFGH) a permis d'atteindre des vitesses de croissances rapides, des consommations de xylose et une production de succinate améliorées par rapport à la souche parente. Après modification génétique, E. coli KJ12201-14T permet de produire en mode une concentration élevée de succinate de 84 g/L, la concentration d'acétate accumulée étant de 11 g/L, à partir d'un milieu de composition adaptée (AM1) contenant 10% de xylose. En fermentation fed-batch, E. coli KJ12201-14T permet de produire du succinate à une concentration de 84 g/L, avec un rendement de 0.85 g/g et une productivité de 2 g/L/h. Ces résultats démontrent les potentialités de cette souche pour produire du succinate à partir de xylose ou d'hydrolysats riches en xylose issus de matières lignocellulosiques. La nanofiltration a ensuite été considérée afin de purifier le succinate obtenu par fermentation. Les expériences ont été réalisées avec une membrane NF45 et des milieux de fermentation synthétiques contenant le succinate et différentes impuretés, sels minéraux, glucose ou autres sels d'acides organiques, acétate en particulier. L'influence des conditions opératoires (pH, pression) sur les performances de la NF a été évaluée. Les mécanismes gouvernant le transfert des espèces à travers la membrane ont été étudiés afin d'expliquer la variation des rétentions en fonction de la composition du milieu. En solution simple, les résultats ont montré que la rétention du succinate augmente avec la pression appliquée et avec le pH et diminue lorsque la concentration augmente. Pour des concentrations faibles, de l'ordre de 0.1M, les rétentions du succinate et de l'acétate en mélange sont différentes et identiques à celles en solution simples. Une bonne purification du succinate est ainsi possible. Au contraire, pour des concentrations plus élevées en succinate, la rétention diminue par suite de l'écrantage des effets de charge. Les rétentions étant trop proches, la séparation acétate/succinate devient impossible. Considérant les mécanismes ainsi mis évidence, une méthodologie a été proposée afin de réaliser la purification du succinate obtenu par fermentation. La séparation acétate/succinate est effectuée en deux étapes. Une diafiltration du jus de fermentation, préalablement dilué, est d'abord réalisée en utilisant la membrane NF45. Le rétentat purifié est ensuite concentré, en utilisant une membrane d'osmose inverse. Grace à ce procédé, il est possible d'augmenter la pureté du succinate de 85 à plus de 99.5% avec un rendement global supérieur à 92%. L'intérêt de la nanofiltration pour purifier le succinate produit par fermentation est ainsi démontrée.

Current trend is to move from primary carbohydrate resources to more complex ones like lignocellulosic materials as a bio-renewable feedstock, to produce biofuels or chemical building blocks. This evolution requires significant modifications at different stages in the bioprocess engineering, including fermentation and downstream processes. In this work, the succinate production by a newly metabolically engineered Escherichia coli from xylose, and its purification from fermentative broth by nanofiltration were studied. Escherichia coli KJ122 strain was previously engineered to produce high titers and yields of succinate in mineral salts medium containing glucose under simple-batch anaerobic conditions. However, this strain does not efficiently utilize xylose due to catabolic repression. To improve the xylose uptake and its utilization of E. coli KJ122, xylFGH genes were inactivated by the gene deletion technique. The mutant strain named KJ12201 (E. coli KJ122 ?xylFGH) exhibited high abilities in fast growth, xylose consumption and succinate production compared to those of the parental strains. After performing metabolic evolution, E. coli KJ12201-14T efficiently consumed 10% xylose to produce a high succinate concentration at 84 g/L with an accumulated acetate concentration at 11 g/L in mineral salts medium (AM1) under batch fermentation. During fed-batch fermentation, E. coli KJ12201-14T produced succinate at a concentration, yield, and overall productivity of 84 g/L, 0.85 g/g, and 1.0 g/L/h, respectively. These results demonstrated that E. coli KJ12201 would be a potential strain for the economic bio-based succinate production from xylose and other xylose-rich hydrolysates derived from lignocellulosic materials. The succinate purification from fermentation broth by nanofiltration (NF) was also investigated. The experiment was carried out with a NF45 membrane and various synthetic fermentation broths containing succinate salt and different impurities such as inorganic salts, glucose, and other organic acid salts including acetate. The influence of the operating conditions (pH, pressure) as well as the broth composition on the NF performances was evaluated. The mechanisms governing the transfer of the solutes through the membrane were studied in order to explain the different solute retentions observed according to the fermentation broth composition. In single-solute solutions, the succinate retention increases with increasing pressure and feed pH and decreases with increasing feed concentration. For instance, at a low salts concentration at 0.1 M, it was observed that the retentions of succinate and acetate in the mixture are identical to those in single solutions. Thus, a good purification of succinate can be obtained. On the contrary, with higher succinate concentrations, the retention was decreased due to the screening effect. Retentions of those solutes were then too close to achieve a separation. Based on abovementioned mechanisms observed, a methodology was proposed to perform the succinate purification from fermentation broth. The succinate/acetate separation was carried out in two steps. A diafiltration of the diluted fermentation broth was initially performed, and the concentration step followed. With this process, it was possible to increase the succinate purity from 85% to more than 99.5% while maintaining a total yield higher than 92%. From this work, it was shown that NF could be effectively used for the succinate purification from fermentation broth.