Pro-drogues antituberculeuses : approches pour lutter contre les résistances et compréhension des mécanismes oxydatifs d'activation

Antitubercular pro-drugs : approaches to fight resistances and understanding of oxidative activation mechanisms

• Auteur / Autrice : Julie Laborde
• Direction : Vania Bernardes-Genisson, Céline Deraeve
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie, biologie, santé
• Date : Soutenance le 18/11/2016
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Matière (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie de Coordination (Toulouse ; 1974-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Promédicaments

Thérapeutique

Tuberculose

Mots clés libres

Tuberculose

Pro-drogues

Isoniazide

Ethionamide

Résistances

Mécanismes oxydatifs d'activation

Tuberculosis

Prodrugs

Isoniazid

Ethionamide

Oxidative activation mechanisms

Résumé

La tuberculose est l'une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. Malgré l'existence d'un traitement polychimiothérapeutique efficace, le nombre de cas de tuberculose incurable augmente sensiblement en raison de l'apparition de souches de Mycobacterium tuberculosis résistantes aux traitements de 1ère, 2ème et 3ème intentions actuellement disponibles. Parmi les antibiotiques spécifiques de la tuberculose, nous nous intéressons plus particulièrement, dans le cadre de cette thèse, aux pro-drogues isoniazide et éthionamide. Ces deux médicaments ciblent l'enzyme InhA du Mycobacterium tuberculosis, qui est impliquée dans la synthèse de la paroi bactérienne. Les principales résistances de Mycobacterium tuberculosis à ces pro-drogues résident en un défaut des enzymes responsables de l'activation de ces médicaments à l'intérieur du pathogène. Le but de cette thèse est, dans un premier temps, d'étudier différentes approches originales visant à contourner ces résistances. La première stratégie consiste à concevoir des pro-drogues hybrides d'isoniazide et d'éthionamide qui pourraient être activées indifféremment par KatG et EthA. KatG est la catalase-peroxydase responsable de l'activation de l'isoniazide, et EthA la mono-oxygénase à flavine qui active l'éthionamide. Les chances de bio-activation de ces nouvelles molécules seraient donc supérieures même si l'une des deux enzymes est mutée. La deuxième stratégie examinée consiste à synthétiser des molécules capables d'être activées par l'enzyme KatG mutée qui reste fonctionnelle. Nous avons alors préparé des molécules analogues de l'isoniazide qui pourraient être éventuellement reconnues et activées par une KatG mutée montrant une modification du potentiel d'oxydation ou de la structure protéique. La dernière stratégie étudiée consiste à synthétiser des molécules qui ne nécessitent pas d'être activées par une enzyme pour exercer leur action mais simplement par des agents oxydants endogènes. En se basant sur une molécule décrite dans la littérature par nos collaborateurs brésiliens, le complexe d'isoniazide-fer(II) ((isoniazide)pentacyanoferrate(II) de sodium), nous avons synthétisé différents analogues de ce complexe en faisant varier le ligand et avons évalué par RPE leur capacité à générer des radicaux. Cette étude de relation structure-réactivité a permis de mieux comprendre le mécanisme d'activation de ces complexes en présence de H2O2. La deuxième partie de cette thèse est consacrée au mécanisme d'activation des pro-drogues isoniazide et éthionamide. Même si ces molécules sont utilisées depuis plus de 50 ans dans le traitement de la tuberculose, leur mécanisme d'activation d'un point de vue chimique est très mal décrit. Dans la mycobactérie, ces pro-drogues, une fois activées, forment un adduit avec le cofacteur NAD(H) donnant ainsi l'inhibiteur ultime de l'enzyme InhA. Dans le cas de l'isoniazide, nous avons utilisé le système biomimétique mis en place dans l'équipe pour étudier son mécanisme d'activation d'un point de vue moléculaire. Dans le cas de l'éthionamide, nous avons développé un système chimique biomimétique qui, pour la première fois, a conduit à la formation de l'adduit éthionamide-NAD+ in vitro. Grâce au succès de cette approche et à la caractérisation des intermédiaires et métabolites formés, nous avons pu proposer un mécanisme d'oxydation moléculaire de l'éthionamide entièrement original, s'affranchissant de l'intermédiaire clé acide sulfinique évoqué jusque-là dans la littérature sans aucune preuve expérimentale.

Tuberculosis is one of the leading causes of death in the world among infectious diseases. Despite the existence of efficient multidrug treatment, the number of incurable cases of tuberculosis substantially increases due to the emergence of Mycobacterium tuberculosis strains resistant to available 1st-, 2nd- and 3rd-lines-treatments. Among the specific drugs currently employed to treat tuberculosis, we particularly focus on pro-drugs (isoniazid and ethionamide) for which resistances mainly result in a default of their activation enzymes inside the pathogen. The aim of this thesis is, firstly, to study various innovative approaches to overcome the resistance. The first strategy consists in designing hybrid pro-drugs, by combination of isoniazid and ethionamide moieties, which could be activated by two different enzymes, KatG and EthA. KatG is the mycobacterial catalase peroxidase enzyme which activates isoniazid, and EthA the flavin monooxygenase responsible of ethionamide activation. Probability of bio-activation of these new molecules would therefore be higher even if one of the two enzymes is mutated. The second strategy discussed herein is the synthesis of molecules able to be activated by mutated KatG enzyme, which remains functional. We synthesized isoniazid derivatives, which might be recognized and activated by a mutated KatG enzyme showing a modification of its oxidation potential or in the protein structure. The last strategy is founded on the development of molecules that do not need to be activated by an enzyme but by a simple chemical oxidation. Based on a molecule described in the literature by our brazilian collaborators, an isoniazid-iron (II) complex (sodium (isoniazid)pentacyanoferrate(II)), we synthesized various analogues of this complex by varying the ligand structure and evaluated by ESR their ability to generate radicals in the presence of H2O2. The structure-reactivity relationship analysis led to better understanding of the molecular activation mechanism of these complexes in the presence of H2O2. The second part of this thesis is dedicated to the activation mechanisms of pro-drugs isoniazid and ethionamide. Even though these molecules have been used for more than 50 years for the treatment of tuberculosis, their activation mechanism on a molecular point of view is poorly described. In the mycobacterium, once activated these pro-drugs form an adduct with the NAD(H) cofactor, leading to the active metabolite. For isoniazid, we used the biomimetic system developed previously by our team to clarify the molecular activation mechanism. For ethionamide, we have developed a biomimetic system which, for the first time, leads to the formation of the ethionamide-NAD+ adduct in vitro. We used this method to study the molecular oxidation mechanism of ethionamide and to characterize intermediates and metabolites. We finally proposed a completely original mechanism, not involving the sulfinic acid intermediate, which has been mentioned in the literature without any experimental evidence.