Maturation de la capside du bactériophage T5 : étude structurale et fonctionnelle de la protéine de décoration pb10

Maturation of the bacteriophage T5 capsid : structural and functional study of the decoration protein pb10

• Auteur / Autrice : Emeline Vernhes
• Direction : Pascale Boulanger
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 30/11/2016
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Minard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Boulanger, Paulo Tavares, David Bikard, Bertrand Raynal
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Pierre Simorre, Mark Van Raaij

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines virales

Interactions protéine-protéine

Résonance magnétique nucléaire

Mots clés libres

Bactériophage T5

Capside

Protéine de décoration

Structure

Rmn

Bacteriopage T5

Capsid

Decoration protein

Structure

Nmr

Résumé

Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, est constitué d’une capside icosaédrique renfermant un ADN double brin et d’une queue permettant le transfert de son ADN dans le cytoplasme de la cellule hôte. Au cours de la morphogénèse, la capside et la queue sont assemblées séparément puis connectées pour former les particules infectieuses. La capside de T5 est d'abord assemblée sous forme d'une procapside vide constituée de 775 copies d’une protéine unique qui s'organise en hexamères et pentamères pour former respectivement les faces et les sommets de l’icosaèdre. Un des sommets est occupé par la protéine portale qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN. L’encapsidation du génome à travers le canal portal, assurée par un moteur moléculaire, provoque l’expansion de la procapside. La capside pleine d'ADN est ensuite décorée par la protéine pb10 qui se fixe sur sa surface externe, au centre des 120 hexamères, et elle est fermée par la protéine p144 qui constitue le point d'ancrage pour la queue.Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer la structure, la fonction et le mécanisme de fixation à la capside des deux protéines pb10 et p144. J’ai produit et purifié la protéine de fermeture p144 dont la structure et les caractéristiques de fixation sur la capside seront prochainement étudiées. J’ai résolu la structure de la protéine de décoration pb10 en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN), ce qui a révélé une protéine formée de deux domaines. Le domaine N-terminal structuré en hélices alpha se fixe à la capside, alors que le domaine C-terminal, de type immunoglobuline, est exposé au solvant. La détermination des constantes cinétiques d'association et de dissociation par résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de montrer que pb10 se fixe sur la capside de T5 de manière quasi-irréversible, avec une affinité de l’ordre du picomolaire. Des expériences de mutagenèse dirigée sur le domaine de fixation de pb10 indiquent que cette forte affinité repose sur un réseau d’interactions électrostatiques et hydrophobes. J’ai démontré que pb10 participe à la stabilisation de la capside de T5 par des techniques de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et thermo-fluorescence (FTSA). Par ailleurs, j'ai démontré qu’il était possible de fusionner des protéines de grande taille au domaine C-terminal de pb10 sans affecter sa haute affinité pour la capside. J’ai ainsi pu fonctionnaliser des capsides avec une protéine d’intérêt fusionnée à pb10. Ces résultats ouvrent la voie vers diverses applications, dont la présentation d’antigènes en vue de créer de nouveaux vaccins.

Bacteriophage T5, a lytic phage which infects the bacterium Escherichia coli, is composed of an icosahedral capsid containing a double stranded DNA and a tail responsible for DNA transfer into the host cell cytoplasm. The capsid and the tail are assembled separately and then connected to form infectious viruses. The T5 capsid is first assembled as an empty procapsid composed of 775 copies of the major head protein organized in hexamers on the faces and pentamers on the vertices of the icosahedron. A single vertex is occupied by the portal protein which forms an entry channel for DNA. DNA is packaged through the portal channel by a molecular motor thus triggering procapsid expansion. The DNA-filled capsid is then decorated by the protein pb10 which binds on the outer surface in the center of each hexamer, and closed by the connector protein p144 needed for tail attachment.The goals of my PhD were to characterize the structure, function and mechanisms of capsid binding of both pb10 and p144 proteins. I have produced and purified the head completion protein p144 for future exploration of its structure and capsid binding properties. I have solved the solution structure of the decoration protein pb10 by nuclear magnetic resonance (NMR), thus unravelling that pb10 has two domains. The alpha-helical N-terminal domain binds to the capsid and the immunoglobulin-like C-terminal domain is exposed to the environment. Surface plasmon resonance (SPR) showed that that pb10 attachment to the T5 capsid is quasi-irreversible with a picomolar affinity. Site-directed mutagenesis of the binding domain of pb10 suggested that the decoration mechanism is driven by both hydrophobic and electrostatic interactions. Differential scanning calorimetry (DSC) and fluorescence thermal shift assays (FTSA) demonstrated the role of the decoration protein in capsid stabilization. I have also demonstrated that a large protein can be fused to the C-terminal end of pb10 without affecting its high affinity for the T5 capsid. Capsids can thus be functionalized with a protein of interest fused to pb10. Possible applications of this work include antigen presentation for new vaccines.